人參提取物對過氧化氫致人神經母瘤細胞損傷的保護作用及機制研究

張慧媛++++++楊擎++++++孫佳明++++++劉英娜++++++林嘉楠++++++石曉征++++++李娜++++++曲曉波

[摘要] 目的 觀察人參提取物對過氧化氫致人神經母瘤細胞（SH-SY5Y）損傷的影響并探討其作用機制。 方法 采用MTT法確定人參二醇總皂苷（PDS）、人參總皂苷（GS）、人參非皂苷（GN）的最佳給藥濃度。將處于對數生長期的SY5Y細胞加入過氧化氫（終濃度為300 μmol/L）孵育4 h造成細胞損傷模型，然后分為模型對照組、PDS給藥組、GS給藥組、GN給藥組，另設空白對照組加入等體積細胞培養液。采用MTT方法檢測細胞活力，Western blot法檢測Nrf2、Keap1、Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表達情況。 結果 與空白對照組相比，模型組對照組SH-SY5Y細胞存活率明顯降低（P < 0.01）；與模型對照組比較，PDS給藥組、GS給藥組、GN給藥組細胞存活率均升高，確定1、10、240 μg/mL為PDS給藥組、GS給藥組、GN給藥組實驗濃度（P < 0.01）。與空白對照組比較，模型對照組SH-SY5Y中Keap1、Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表達水平明顯增加（P < 0.05或P < 0.01），Bcl-2、Nrf-2表達明顯降低（P < 0.01）；與模型組對照組比較，PDS給藥組、GS給藥組SH-SY5Y中Keap1、Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表達水平明顯降低（P < 0.05或P < 0.01），Bcl-2、Nrf-2表達明顯增高（P < 0.01）。 結論 人參提取物中PDS與GS對過氧化氫致人神經母瘤細胞SY5Y細胞損傷具有保護作用，其機制可能與通過激活SH-SY5Y細胞內Nrf-2通路抑制氧化應激、降低其凋亡發生有關。

[關鍵詞] 人參二醇總皂苷；人參總皂苷；人參非皂苷；過氧化氫；神經母瘤細胞損傷

[中圖分類號] R329.25 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（c）-0013-05

Protective effect and mechanism of ginseng extract on human neuroblastoma injury induced by hydrogen peroxide

ZHANG Huiyuan YANG Qing SUN Jiaming LIU Yingna LIN Jia′nan SHI Xiaozheng LI Na QU Xiaobo

Molecular Pharmacology Laboratory， Changchun University of Traditional Chinese Medicine R&D Center， Jilin Province， Changchun 130117， China

[Abstract] Objective To observe the influence of ginseng extract on the injury induced by hydrogen peroxide in human neuroblastoma cells （SH-SY5Y） and explore its mechanism. Methods The optimal concentrations of panaxadiol saponins （PDS）， ginsenoside（GS） and ginseng non-saponin（GN） were determined by the MTT assay. SY5Y cells in the logarithmic growth phase were supplemented with hydrogen peroxide （final concentration of 300 μmol/L） and were incubated for 4 h. The cell injury model was established. SY5Y cells were divided into model control group， PDS group， GS group and GN group. A blank control group was added to an equal volume of cell culture fluid. MTT assay was used to detect the cell viability. The protein expressions of Nrf2， Keap1， Bcl-2， Bax， Caspase3 and Caspase9 were detected by Western blot. Results Compared with the blank control group， the survival rate of SH-SY5Y cells in the model control group was significantly decreased （P < 0.01）. Compared with the model control group， the survival rates of PDS group， GS group and GN group increased， and the concentration of 1， 10， 240 μg/mL was selected as test concentration in PDS group， GS group and GN group （P < 0.01）. Compared with the blank control group， the protein levels of Keap1， Bax， Caspase3 and Caspase9 in SH-SY5Y of model control group were significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the protein levels of Bcl-2 and Nrf-2 were significantly decreased （P < 0.01）. Compared with the model control group， in PDS group and GS group the protein levels of Keap1， Bax， Caspase3 and Caspase9 were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the protein levels of Bcl-2 and Nrf-2 were significantly increased （P < 0.01）. Conclusion PDS and GS from ginseng extract can protect human SH-SY5Y cells from the hydrogen peroxide-induced damage， and the mechanism may inhibit the oxidative stress by activating the Nrf-2 pathway in SH-SY5Y cells， and reduce apoptosis.endprint

[Key words] Panaxadiol saponins； Ginsenoside； Ginseng non-saponin； Hydrogen peroxide； Neuroblastoma injury

氧自由基對腦神經細胞具有氧化修飾作用，是導致神經元損傷的主要途徑之一[1]。近年來越來越多的資料證明，氧化應激和線粒體參與可能是阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）主要的觸發因素[2]。細胞內的活性氧（reactive oxygen species，ROS）通過誘導抗氧化反應元件（ARE）驅動基因核轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）的激活引起細胞抗氧化反應[3-4]。人參皂苷是人參主要活性成分，可以通過抗凋亡、抗氧化等一系列機制保護神經[5]。有研究表明，人參皂苷Rg1可以修復過氧化氫誘導的氧化損傷[6]，其作用機制與抗氧化抑制細胞凋亡相關[7]。本研究主要觀察人參提取物中人參二醇型總皂苷（panaxadiol saponins，PDS）、人參總皂苷（ginsenoside，GS）、人參非皂苷（ginseng non-saponin，GN）對過氧化氫誘導的SY5Y細胞損傷的影響，并探討其機制與抑制氧化應激及凋亡的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 SH-SY5Y細胞由吉林大學基礎醫學院藥理實驗室提供。

1.1.2 主要試劑 人參二醇型總皂苷（hongjiu biotech公司，批號161204），人參總皂苷（hongjiu biotech公司，批號161101），人參非皂苷長春中醫藥大學自制。使用時用1640培養液稀釋配制成所需濃度工作液。β-actin（美國Proteintech公司，批號66009-1-Ig），Nrf2（美國Proteintech公司，批號16396-1-AP），Keap1（美國Proteintech公司，批號10503-2-AP），Bcl-2（美國Proteintech公司，批號12789-1-AP），Bax（美國Proteintech公司，批號50599-2-Ig），Caspase3（美國Proteintech公司，批號20538-1-AP），Caspase9（美國Cell Signaling Technolocy公司，批號#14697）。過氧化氫（北京化工廠，批號：20160218），四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國Amresco 公司，批號40201ES80），RPMI-1640（美國Corning公司，批號10-040-CVR），組織細胞裂解液（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號：WB-0061），胎牛血清（美國Gibco公司，批號FB15015），BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司，批號CW0051S）。

1.1.3 儀器 酶標儀（TECAN公司），蛋白電泳儀（Hoffer公司），轉膜儀（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及藥物處理 將SH-SY5Y細胞用RPMI-1640培養基（10%胎牛血清，1%雙抗）放入含有5%CO2、37℃培養箱中培養。待細胞處于對數生長期進行實驗及相關指標檢測。SH-SY5Y細胞分為空白對照組、模型對照組、PDS給藥組、GS給藥組、GN給藥組。細胞接種24 h后配PDS濃度為1、5、10 μg/mL；GS濃度為10、50、100 μg/mL；GN濃度為240、1200、2400 μg/mL培養24 h。除空白對照組外均給予過氧化氫300 μmol/L孵育細胞4 h，消化收集細胞測定各項指標。

1.2.2 細胞存活率測定 采用MTT法。SH-SY5Y細胞以每孔4×104個/mL接種于96孔板中，每組細胞8復孔，培養結束前4 h每孔加入20 μL MTT，培養結束后吸去培養液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min后，使結晶完全溶解，在490 nm波長下測定吸光度（A）值。空白對照組細胞存活率設為100%，計算其余各組細胞存活率。細胞存活率=（各實驗組A值/空白對照組A值）×100%。

1.2.3 氧化應激相關凋亡蛋白表達的檢測 采用Western blot法。細胞經分組處理后胰酶消化收集，提取蛋白，進行SDS-PAGE垂直電泳，然后電轉至PVDF膜上，轉膜后用TBST清洗膜3次，脫脂奶粉封閉1 h，再用TBST洗膜。將膜放入稀釋好的β-actin、Nrf2、Keap1、Bcl-2、Bax、Caspase9和Caspase3抗體中，4℃孵育過夜，在二抗中室溫孵育1 h，TBST洗膜，在BCIP/NBT顯色液中避光顯色，用凝膠成像分析系統測定灰度值。各組蛋白表達相對強度=每個樣本條帶灰度值/β-actin條帶灰度值，進行半定量分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 11.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度梯度PDS、GS、GN對SY5Y細胞抗凋亡作用24 h篩選

與空白對照組相比，模型對照組細胞存活率明顯降低（P < 0.01）；與模型對照組比較，PDS給藥組1、5、10 μg/mL細胞存活率顯著升高（P < 0.01），選取有效濃度的最低劑量即1 μg/mL做后續指標檢測；GS給藥組、GN給藥組分別選取有效濃度的最低劑量為10、240 μg/mL做后續指標檢測（P < 0.01）。

2.2 人參提取物對過氧化氫損傷SH-SY5Y細胞形態的影響

處理后的細胞于倒置顯微鏡下觀察并拍照。實驗結果表明：空白對照組細胞胞體呈梭形；模型對照組細胞數量減少，胞體皺縮，且有的細胞呈圓形；與模型對照組相比，PDS給藥組、GS給藥組細胞數量增多，胞體皺縮現象明顯改善；GN給藥組胞體皺縮現象明顯改善，但是數量增多不明顯。見圖1。endprint

2.3 人參提取物對過氧化氫損傷SH-SY5Y細胞氧化應激相關蛋白表達水平的影響

與空白對照組相比，模型對照組Nrf2表達明顯減少（P < 0.01），Keap1表達明顯增加（P < 0.01）；與模型對照組相比，PDS給藥組、GS給藥組Nrf2表達明顯增加（P < 0.01），Keap1表達明顯減少（P < 0.01），GN給藥組Nrf2表達水平增強不明顯（P > 0.05），Keap1表達水平明顯減弱（P < 0.01）。

2.4 人參提取物對過氧化氫損傷SH-SY5Y細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響

與空白對照組相比，模型對照組Bcl-2表達水平明顯減弱（P < 0.01），Bax、Caspase9、Caspase3表達水平明顯增強（P < 0.05或P < 0.01）；與模型對照組相比，PDS給藥組、GS給藥組Bcl-2表達水平明顯增強（P < 0.01），GN給藥組Bcl-2表達水平增強不明顯（P > 0.05）；PDS給藥組、GS給藥組、GN給藥組Bax、Caspase9、Caspase3表達水平較模型對照組明顯減弱（P < 0.05或P < 0.01），但GN給藥組減弱效果稍弱。見圖3、表5。

3 討論

人參皂苷具有多靶點、毒副作用小等優勢，已成為近年來治療神經退行性疾病的研究熱點[8]。氧化應激在神經退行性疾病相關的神經細胞死亡中發揮重要作用[9-10]，Nrf2在細胞抗氧化反應中發揮關鍵作用[11]。正常生理狀態下Nrf2被Keap1限制在細胞漿內，當發生氧化應激時，Keap1與Nrf2解聯，新合成的Nrf2轉移到細胞核內，識別并結合ARE，從而啟動下游抗氧化蛋白基因的轉錄，提高細胞的抗氧化能力[12]。Keap1-Nrf2信號傳導已成為預防和治療氧化應激相關疾病和病癥的有吸引力的靶標[13-14]。AD患者腦中Nrf2定位在細胞核，表達水平較正常對照組明顯下降[15]。本研究采用300 μmol/L過氧化氫處理SH-SY5Y細胞誘發氧化應激損傷，利用MTT對3種不同人參提取物篩選最佳濃度，采用有效濃度的最低劑量進行實驗，最終確定以1、10、240 μg/mL為PDS給藥組、GS給藥組、GN給藥組實驗濃度，進行后續Western blot指標檢測。結果發現：與空白對照組相比，模型對照組Nrf2表達水平明顯減少，Keap1表達水平明顯增強。與模型對照組相比，PDS給藥組、GS給藥組SH-SY5Y細胞Nrf2表達水平明顯增強，Keap1表達水平明顯減弱；GN給藥組Nrf2表達水平增強效果不明顯，Keap1表達水平減弱效果明顯。說明PDS與GS有抗氧化應激的神經保護作用，能阻止Nrf2與其阻遏蛋白Keap1結合，從而使Nrf2更好地發揮抗氧化作用，GN抗氧化效果不如PDS與GS明顯。

Bax是最早發現的促凋亡家族成員，在正常細胞中主要存在于細胞質中，受到凋亡刺激后轉位到線粒體上，引起細胞色素C的釋放[16]。Bcl-2是其家族蛋白中最主要的抗凋亡蛋白，Bcl-2/Bax組成一個體系，Bax表達增多，可致細胞凋亡，而Bcl-2表達增多則抑制細胞凋亡[17]。Caspase9作為凋亡啟動因子處于級聯反應的上游，可以識別及激活下游的Caspase-3。Caspase-3在細胞凋亡過程中作為主要效應因子，其活化是細胞進入凋亡不可逆階段的標志[18-20]。本研究分別采用PDS、GS與GN處理過氧化氫損傷神經細胞，比較其抗凋亡作用，結果表明，與空白對照組相比，模型對照組Bcl-2表達水平明顯減弱，Bax、Caspase9、Caspase3表達水平明顯增強；與模型對照組相比，PDS給藥組、GS給藥組Bcl-2表達水平明顯增強，GN給藥組Bcl-2表達水平增強不明顯；PDS給藥組、GS給藥組、Bax、Caspase9、Caspase3表達水平明顯減弱，GN給藥組減弱效果稍弱。說明PDS與GS具有抑凋亡、保護神經細胞的作用，GN抗凋亡效果不如PDS與GS明顯。

綜上所述，PDS與GS可能通過促使受損SY5Y細胞中Nrf2與Keap1脫離進入細胞核，提高下游抗凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax比值，抑制Caspase-9、Caspase-3表達，提高細胞的存活率，因此，PDS與GS對過氧化氫誘導的細胞損傷起到保護作用。機制可能與激活Nrf2信號通路并抑制凋亡有關。PDS與GS是否可以作為一種潛在治療AD的藥物，還有待進一步研究。

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（收稿日期：2017-07-17 本文編輯：程 銘）endprint