膝關節骨性關節炎動物模型建立的研究現狀

宋寒冰++++++趙峰++++++葛圓圓2++++++楊丹++++++于英君

[摘要] 本文基于對膝關節骨性關節炎病因和治療機制的基礎研究的不斷探索，深入分析發現當前建立骨關節炎動物模型所選動物以鼠、兔為主，其他動物如狗、豬、雞等應用較少。常用造模方法主要有自發性模型、手術造模以及其他方法等，不同動物及不同方法有著較為嚴格的區別，因此在選擇模型時應根據研究需要綜合考慮。

[關鍵詞] 膝關節；骨關節炎；動物模型

[中圖分類號] R684.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（c）-0046-04

Research status of establishment of animal model of knee osteoarthritis

SONG Hanbing1 ZHAO Feng2 GE Yuanyuan2 YANG Dan2 YU Yingjun3▲

1.The Third Department of Orthopaedics， the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 2.Graduate School， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 3.School of Basic Medicine， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China

[Abstract] Based on the continuous exploration on the fundamental researches of etiology and treatment mechanism of knee osteoarthritis， this paper takes in-depth analysis and finds that the animals used for establishing animal models with osteoarthritis at present are mainly rats and rabbits， the application of other animals， such as dogs， pigs， chickens and others， is less. The commonly model replicating methods are spontaneous models， operation models， and other methods， different animals and different methods have relatively strict distinction， so the choice of models should be based on the need of study.

[Key words] Knee joint； Osteoarthritis； Animal model

膝關節骨性關節炎是在骨科臨床中常見的一種以關節退行性改變為主的疾病，中老年人群多發，主要癥狀為膝關節增生樣腫脹、關節內翻畸形、屈伸活動受限，負重行走尤其上下樓梯時疼痛明顯加重，關節磨糙音、彈響，部分患者會出現關節腔積液[1]。目前，對于膝關節骨性關節炎的臨床和基礎研究越來越廣泛，但是膝骨性關節炎發生的病因和治療機制的基礎研究尚不豐富，有待于進一步的探索。在試驗過程中，能夠制造最為接近人的膝關節骨性關節炎的病因及轉歸的動物模型則尤其重要。

經過造模方法的不斷深入研究，膝關節骨性關節炎的造模方法較多，利用兔和大鼠來造模的方式是最為常見的，動物模型一般有自發性模型、誘發性模型、手術方法造模等。為了能夠更順利地完成膝關節骨性關節炎的相關動物實驗，在目前文獻研究報道的基礎上，本文總結了動物模型的常見建立方法，以利于研究者能夠更順利地運用膝關節骨性關節炎動物模型來進行實驗研究。

1 鼠類模型的制作

1.1 喂養造模

Silberberg等[2]給以含高脂肪、高動物油脂的飼料喂養C57BL小鼠，經過研究發現骨關節炎出現率較高，脂肪酸Omega-3代替必需脂肪酸Omega-6可導致關節軟骨纖維的退行性改變。

1.2 自發性模型

許多動物可以因自身關節軟骨退變形成骨關節炎，這種骨關節炎甚至不需任何干預。由Silberberg等[3]經過觀察發現C57黑鼠和STRPort小鼠具有可以自我發生骨性關節炎的特征，主要累及脛內側軟骨，雄性STRPort小鼠病變較重，發生率較高[4]。激素水平影響可以產生自發性模型，研究發現性激素可以干預雌性STRPort小鼠轉化生長因子β1與白介素-4表達，此效應可以保護關節軟骨，降低關節軟骨炎的發生率[5]。另外，Yamamoto等[6]通過對栗鼠行走方式進行干預，使其以特殊的步態行走，發現當栗鼠以這種步態行走一段時間后，栗鼠踝關節軟骨的邊緣會出現不同程度的增生、關節面龜裂等形態變化，光鏡觀察可以發現，栗鼠關節產生類似于人類骨關節炎病理變化的改變，如軟骨細胞數目減少、排列紊亂等。這些改變可以進行類似骨關節病遺傳學及關節軟骨細胞退行性改變方面的研究[7]。

1.3 基因技術模型

轉基因技術的不斷創新，骨關節炎動物模型可以通過基因技術來實現，目前主要是Col9a1和Col2a1基因部分縮短、缺失或者基因的突變、銅轉運基因缺陷、Col11a1基因的1-bp處缺失、MMP-13基因的過度表達以及組織特異性BMP-1a型受體缺乏等，以及下列基因的敲除，這些基因包括ADAM-15基因、MMP-14基因、白介素-6基因、Mig-6基因、a-1整合素基因、纖維調節素和基膜聚糖基因雙鏈、纖維調節素和二聚糖基因單鏈或者雙鏈等。研究發現，調控軟骨細胞凋亡的基因被剔除，軟骨細胞退變，破壞速度會加速[8]。Arita等[9]發現并制造轉基因小鼠模型，表達人突變Ⅱ型前膠原基因，電鏡下發現相比于正常組，軟骨示Ⅱ型膠原纖維的密度減少，此等變化與因該基因突變而造成的全身骨關節炎患者相似。endprint

雖然轉基因小鼠骨關節炎模型對于研究骨關節炎發病中的特殊基因或蛋白質的作用十分重要，然而骨關節炎的發病機制是基因的異常，并不能反映臨床上因勞累、環境因素等造成的關節炎，另外，進行基因改造后的實驗動物是否具有其他可引起關節改變的病理變化尚不明確，因此轉基因能否作為評價骨關節炎治療方法的普通模型還存在爭議。

1.4 關節固定

如果將大鼠關節較長時間固定，可以導致關節軟骨的退變，從而產生關節炎。如果固定于關節伸直位時施加壓力可以加大關節面壓力和磨損，從而促進關節炎發生的進程。另有學者通過采用過屈位和過伸位將模型進行固定，發現兩者均能得到滿意的動物模型，但過屈位造模方法優于過伸位所造的模型[10]。

1.5 關節注射

盧鋒等[11]將白陶土的生理鹽水懸浮液和弗式佐劑注射液分別注射于大鼠后肢踝趾關節，用來觀察鹽酸氨基葡萄糖抑制骨關節炎的病變程度，結果顯示鹽酸氨基葡萄糖對骨性關節炎存在保護作用，具有輔助性療效。Hagmann等[12]對雄性Wistar大鼠的膝關節注射碘乙酸鈉，建立膝關節骨性關節炎模型，該方法比較簡便。

1.6 Hulth法造模

在動物實驗中，早期曾有關節內手術方法，但關節內手術方法容易導致創傷性滑膜炎對實驗的干擾，因此目前較為常用的手術方法為Hulth法，采用Hulth法制作鼠類動物模型，首先將膝關節的內側副韌帶離斷，然后把內側半月板和前后交叉韌帶依次切除，飼養8周后即可成功制作出所需要的動物模型。例如有學者報道，將4～5個月齡大鼠以上述方法制得模型[13]。有學者[14]選擇豚鼠作為實驗動物進行研究，方法主要是切斷豚鼠的臀大肌和深面臀小肌、臀中肌，來對髖關節的平衡維持能力、穩定能力以及負重能力進行干預性破壞。12周之后，研究人員發現其膝關節的軟骨面出現水平裂隙及軟骨剝脫等早期骨關節炎的典型表現，軟骨細胞形成灶巢樣增生、雙柱狀病理改變，可以見到新骨的形成。豚鼠關節軟骨表面在24周之后，可以觀察到破潰更加嚴重，呈絨毛樣外觀，裂隙加深，軟骨下骨常常呈象牙狀裸露。這種造模通常不會造成創傷性滑膜炎，因此可以作為骨關節炎早期病理變化的較好模型。

1.7 誘發性模型

寒冷刺激誘發模型、藥物誘發模型是誘發性模型的兩種主要類型，其中藥物誘發模型主要的造模方式是藥物的關節腔內注射，常用的藥物主要有雌激素、蛋白水解酶、腎上腺皮質激素、尿激酶、腫瘤壞死因子、白介素等，由于這些藥物影響了膝關節軟骨的代謝，直接對關節軟骨造成了破壞，因而誘發骨關節炎。

寒冷刺激可以誘發關節液成分的改變，進一步改變滑膜通透性，對關節軟骨的內環境造成破壞，可誘發關節炎。此外，寒冷刺激可以造成關節軟骨的直接損傷，研究發現，局部凍瘡6個月后可發現誘發關節軟骨微小的損傷，12個月后可以觀察到關節更加顯著的損傷[15]，因此可以說明，關節損傷后常在受傷的數月后或數年后發生關節疼痛，尤其是在冬季容易加重。林木南等[16]在研究中指出，寒冷刺激可以使細胞排列紊亂，細胞顯著簇集，可見細胞核縮、核溶、甚至細胞消失等現象，基質染色不均、淡染，導致結構明顯疏松，膠原纖維顯著減少，新生毛細血管出現在軟骨中，軟骨退化現象十分顯著。

關節軟骨及其附近的內環境十分脆弱，即使只是每日多次注射10%鹽水，就算是生理鹽水也可以誘發骨關節炎。因而得知，關節內環境的改變影響了關節軟骨代謝，兩者關系十分密切，這種微創非特異性造模方法也可以作為較理想的造模方法用于研究藥物對膝關節病的治療。

1.8 其他方法造模

劉安軍等[17]根據長期低溫環境可導致關節炎的理論，采用冷水（溫度約為4℃）對小鼠冷凍刺激方式進行膝關節造模。在造模后的第30天，觀察小鼠的膝關節的狀態并對其腫脹程度評分，提取膝關節軟骨組織作標本，檢測其血清中透明質酸水平以及腫瘤壞死因子含量。第30天時發現模型組小鼠關節炎指數（AI）遠高于正常組，最高可達3.8，對模型小鼠進行蘇木精-伊紅染色，可見小鼠典型的骨關節炎病變，模型組血清中透明質酸、腫瘤壞死因子-α的含量顯著升高，出現骨關節炎典型的病理改變，而且其血清中腫瘤壞死因子和透明質酸的含量都可見明顯升高，說明冷水刺激可導致小鼠骨關節炎，這種造模方法可作為具有地域特異性的骨關節炎模型。

有學者發現，小鼠在行卵巢切除術后會出現明顯的關節軟骨退變，而且代表軟骨變化的CTX2Ⅱ和代表骨吸收的CTX2Ⅰ顯著升高[18]。這表明，關節變化與CTX2Ⅱ和CTX2Ⅰ的水平呈明顯相關性，這說明了卵巢分泌的一類激素可以對關節軟骨起到一定的保護作用，并且得出卵巢切除術可用于激素水平及年齡相關的骨關節炎動物模型。

2 兔模型的制作

2.1 Hulth法造模

兔模型也多以Hulth法為主，兔Hulth法[19]為兔經典手術干預造模方法，其方法大致為：以耳緣靜脈麻醉法麻醉實驗兔，實驗組是將兔的膝關節皮下組織切開，將內側副韌帶、前后交叉韌帶切斷，把內側半月板一同完整切除，術后常規處理，固定但不制動傷肢，1周后每天驅趕兔子行走2次，共30 min，連續4周。當實驗兔因手術導致膝關節正常力線破壞時，關節負重面減少，局部受力更加集中，導致關節軟骨磨損程度增加，加重了其退行性變的速度，促使關節軟骨發生退行性改變。3個月后對實驗兔受損關節的觀察顯示，軟骨出現裂隙、破壞[20]。

對實驗兔采用Hulth造模法進行實驗時，骨關節常常會出現類似骨關節炎中晚期的改變，病變較重，因此學者往往對其進行改良，例如李炳輝等[21]應用改良Hulth法進行實驗造模，其主要步驟為將實驗兔下肢內側副韌帶、內側半月板以及前交叉韌帶切斷，在Hulth法操作中保留后交叉韌帶，自術后1周每天驅趕實驗兔行走30 min，并持續16周。16周后可同樣發現實驗兔的膝關節內側關節間隙不同程度的變窄，關節面明顯不平，邊緣骨贅形成，細胞檢測可見軟骨胞膜破損，細胞核固縮。相對于傳統Hulth法，改良后創傷較小，操作簡單，一定程度上維持了膝關節的穩定性，更有利于造模成功。endprint

2.2 其他造模方法

除了Hulth法之外，李釗等[22]使用小針刀在20只實驗大兔脛骨平臺、雙側股骨髁軟骨表面上刻痕，每一側刻痕均為4～5道，刻痕不超過軟骨層，不能損傷半月板，術后第2天開始每天驅趕動物活動半小時。由于小針刀閉合刻痕對關節滑膜影響小，故該方法不會出現滑膜炎等。該方法5周后發現造模組關節軟骨具有典型的骨關節炎病理改變。

Okazaki等[23]通過將實驗兔下肢關節伸直位制動持續14 d后，兔關節的軟骨可以見到早期退變改變，制動28 d后可見到關節軟骨退變程度達中度，42 d后則可達重度退變，同時發現p53 mRNA參與該過程的發生。一份實驗[24]以成年新西蘭大白兔為實驗動物，將其左后肢膝關節固定于伸直位，造模6周后對比其左右后肢關節軟骨及滑膜發現，關節軟骨細胞在制動后1周即開始發生凋亡，6周時無論從微觀或宏觀角度，實驗兔手術關節均符合呈典型的骨關節炎病理改變特征。

3 其他動物模型的制作

相比于上述實驗動物，因實驗動物倫理要求，其他模型在實踐中應用相對較少，僅僅在某些特殊方法時才考慮應用。有學者嘗試以關節鏡切除豬雙膝外側部分半月板，術后12周時大體觀察結果表現為局限性軟骨表面纖維化，伴股骨髁間切跡骨贅形成；組織學檢測表現為軟骨細胞數量和蛋白多糖含量減少、成簇排列細胞數量增加，說明已產生退行性變；核磁檢查表現為軟骨厚度變薄、軟骨信號強度改變[25]。因此以關節鏡行半月板部分切除能有效建立豬雙膝關節骨性關節炎動物模型，但因關節鏡設備限制，關節鏡造模僅在大型動物中可以應用。

易彩霞[26]嘗試以豬為實驗對象進行造模，其方法為取外側入路進入豬左膝關節腔，將其前交叉韌帶切斷后并完全將外側半月板切除。右側膝關節不予處理作為空白對照側。以手術方式建立以豬為實驗對象的活體骨關節炎動物模型，觀察關節軟骨退變的不同階段和T1ρ和T2mapping成像變化。然后分析膠原含量（軟骨番紅O染色和Van Gieson染色后所測OD值）、T2值、T1ρ值蛋白多糖（PG）含量，并分析它們之間的相關關系。此方法由于幾乎完全不同于以前的任何研究方法，與臨床的實際情況更加接近，其結論為：退變的軟骨T2值、T1ρ值的改變與退變軟骨中蛋白多糖含量和膠原含量的改變相關。在檢測蛋白多糖含量時，與T2mapping比較，T1ρ成像更為敏感；而在檢測膠原含量的過程中，T2mapping更敏感。

因實驗兔關節內劃痕可造成滑膜損傷，因此為了避免這一點，Marijnissen等[27]提出一種新的關節刻痕造模方法，以狗為實驗動物，在不損傷軟骨下骨的前提下，在狗的膝關節軟骨上用圓絞刀人為造成軟骨劃痕，術后將對側肢體限制活動，并以術肢負重活動，每周3 d，每天4 h，持續20周。造模后發現關節軟骨局部可出現明顯變性的軟骨細胞、基質中異染物質消失等類似人類臨床中膝關節骨性關節炎的病理改變，且關節炎癥相對輕微，因此這種方法可作為一個觀察骨關節炎早期表現及治療效果的理想模型。另外，劉媛等[28]以雞為實驗動物，對其膝關節進行冰水浴，每天冰浴2 h，共進行30 d，然后利用電鏡掃描進行觀察，可以發現軟骨表面出現波浪狀低平的病理性結構，拱形結構明顯消失，表面部分出現斷裂，出現軟骨細胞及膠原纖維裸露等退行性改變。

[參考文獻]

[1] 陳臨新.膝關節骨關節炎的診療[J].中國全科醫學，2009， 12（2B）：297-298.

[2] Silberberg M，Silberberg R. Effects of a high fat diet on the joints of aging mice [J]. AMA Arch Pathol，1950，50（6）：828-846.

[3] Silberberg M，Silberberg R. Age changes of bones and joints various strains of mice [J]. American Journal of Anatomy，1941，68（1）：69-95.

[4] Prieto-Alhambra D，Judge A，Javaid MK，et al. Incidence and risk factors for clinically diagnosed knee，hip and hand osteoarthritis：influences of age，gender and osteoarthritis affecting other joints [J]. Ann Rheum Dis，2014， 73（9）：1659-1664.

[5] 陳福靈，張健.膝關節骨性關節炎治療進展[J].檢驗醫學與臨床，2013，10（12）：1596-1598.

[6] Yamamoto K，Shushed T，Mazurka T，et al. Morphs logical studies on the ageing and osteoarthritis of the auricular cartilage in C57 black mice [J]. J Orton Surge（Hong Kong），2005，13（1）：8-18.

[7] Yamamoto H，Iwase N，Kohno M. Histopathological characterization of spontaneously developing osteoarthropathy in the BCBC/Y mouse established newly from B6C3F1 mice [J]. Exp Toxicol Pathol，1999，51（1）：15-20.

[8] 章權，章建華.骨關節炎軟骨細胞凋亡及其調控基因的研究進展[J].浙江中西醫結合雜志，2013，23（3）：242-244.endprint

[9] Arita M，Li SW，Kopen G，et al. Fertala. Skeletal abnormalities and ultrastructural changes of cartilage in transgenic mice expressing a collagen Ⅱ gene（COL2A1）with a Cys for Arg-α1-519 substitution [J]. Osteoarthritis Cartilage，2002，10（10）：808-815.

[10] 張引紅，李美寧，王春芳，等.補骨脂素對類風濕性關節炎小鼠模型的免疫調節作用[J].中國實驗動物學報，2017， 25（2）：207-210.

[11] 盧鋒，郭紅衛.鹽酸氨基葡萄糖對骨關節炎作用機制的初步探討[J].衛生研究，2003，32（6）：594-597.

[12] Hagmann S，Moradi B，Frank S，et al. Different culture media affect growth characteristics，surface marker distribution and chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells [J]. BMC Musculoskelet Disord，2013，14：223.

[13] 余闐，彭力平，馬篤軍，等.牛膝總皂苷對實驗兔膝骨關節炎滑膜組織的影響[J].中國中醫骨傷科雜志，2017， 25（6）：1-5.

[14] 閆金銀.甲狀旁腺激素1-34對DH豚鼠原發性膝骨性關節炎的潛在保護作用及其作用機制[D].石家莊：河北醫科大學，2016.

[15] 邢潤麟，王培民，茆軍，等.基于thermoTRP介導冷痛敏機制對膝骨關節炎虛寒冷痛的研究[J].南京中醫藥大學學報，2016，32（4）：347-348.

[16] 林木南，李西海，林艷紅，等.溫熱疏密波不同波段對實驗性膝骨性關節炎軟骨病理變化的影響[J].康復學報，2016，26（1）：38-42.

[17] 劉安軍，陳宏碩，張國蓉.小鼠骨性關節炎的模型制備及評價[J].中國現代醫學雜志，2008，18（8）：1045-1053.

[18] Amiot A，Mansour H，Baumgaertner I，et al. The detection of the methylated Wif-1 gene is more accurate than a fecal occult blood test for colorectal cancer screening [J]. PLoS One，2014，9（7）：e99233.

[19] Weimer A，Madry H，Venkatesan JK，et al. Benefits of recombinant adeno-associated virus（rAAV）-mediated insulinlike growth factor Ⅰ（IGF-Ⅰ）overexpression for the long-term reconstruction of human osteoarthritic cartilage by modulation of the IGF-Ⅰ axis [J]. Mol Med，2012，18（1）：346-358.

[20] 袁鈺祺，張海寧，孔霞，等.骨髓間充質干細胞中環氧化酶2及聚蛋白多糖酶1沉默與胰島素樣生長因子1過表達[J].中國組織工程研究，2015，19（10）：1488-1494.

[21] 李炳輝，牛東生，孫璽淳，等.直立負重法與Hulth法建立兔膝骨關節炎模型的對比研究[J].寧夏醫科大學學報，2013，35（3）：256-257.

[22] 李釗，節曉光，蘇紅梅，等.閉合關節刻痕法骨性關節炎動物模型的建立[J].貴陽中醫學院學報，2007，29（6）：63-64.

[23] Okazaki R，Sakai A，Ootsuyama A，et al. Apoptosis and p53 expression in chondrocytes relate to degeneration in articular cartilage of immobilized knee joints [J]. J Rheumatol，2003，30（3）：559-566.

[24] 程紅，楊敏.電針調控新西蘭兔骨關節炎性疼痛及對脊髓IL-17、IL-17R表達的影響[J].重慶醫學，2017，46（17）：2326-2327.

[25] 李忠，楊柳，戴剛，等.關節鏡下半月板部分切除制備骨關節炎動物模型[J].第三軍醫大學報，2007，5（29）：919-920.

[26] 易彩霞.硫酸軟骨素、前列腺素E2對豬軟骨細胞增殖分化以及胞內鈣響應影響研究[D].重慶：重慶大學，2014.

[27] Marijnissen AC，van Roermund PM，Verzijl N，et al. Steady progression of osteoarthritic features in the canine groove model [J]. Osteoarthritis Cartilage，2002，10（4）：282-289.

[28] 劉媛，趙駐軍，王紅芹，等.寒冷刺激雞膝關節軟骨顯微結構變化觀察[J].河北農業大學學報，2008，31（2）：93-95.

（收稿日期：2017-06-21 本文編輯：張瑜杰）endprint