生鮮羅非魚片專用復合天然防腐劑工藝優化

摘 要：以總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量和菌落總數為指標，應用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術比較研究8 種不同天然防腐劑對生鮮羅非魚片中腐敗菌生長的影響，并根據8 種天然防腐劑抑菌譜互補的原則配制出羅非魚片專用的復合天然防腐劑，配方為20%生姜溶液、20%大蒜溶液、0.6 g/100 mL魚精蛋白、1.2 g/100 mL殼聚糖。按此配方配制的復合天然防腐劑能夠有效抑制羅非魚片中腐敗菌的生長，使貯藏在4 ℃有氧冷藏條件下的生鮮羅非魚片的保質期延長至15 d以上，而不使用防腐劑的生鮮羅非魚片保質期僅為9 d。

關鍵詞：羅非魚片；天然防腐劑；變性梯度凝膠電泳；菌落總數；總揮發性鹽基氮

Optimization of the Formulation of Natural Preservative Mixtures for Fresh Tilapia Fillets

MENG Xiaohua

（School of Food Engineering， Hebi Polytechnic， Hebi 458030， China）

Abstract： In this experiment， polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE） was adopted to evaluate the effect of eight different natural preservatives on the growth of spoilage microorganisms in fresh tilapia fillets and the effect on total volatile basic nitrogen （TVB-N） content and aerobic plate count （APC） was also investigated. Taking into account their synergism， a preservative mixture was formulated containing 20% ginger juice， 20% garlic juice，

0.6 g/100 mL protamine， and 1.2 g/100 mL chitosan. This mixture could effectively inhibit the growth of spoilage microorganisms in tilapia fillets and prolong the shelf life to over 15 days compared to only 9 days for samples without any preservative treatment stored at 4 ℃.

Key words： tilapia fillets； natural preservative； denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）； bacterial population；

total volatile basic nitrogen （TVB-N）

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201708004

中圖分類號：TS254.4 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）08-0018-05

防腐劑保鮮技術是借助天然或合成化學成分的殺菌或抑菌作用，單獨或與其他保鮮方法相結合的保鮮方法。在生鮮魚片中添加合成防腐劑一般不易被消費者接受，近年來，乳酸鏈球菌素（nisin）[1-2]、茶多酚[3-5]、殼聚糖[6-7]等安全、有營養的生物保鮮劑得到了廣泛關注，但目前的研究多單獨將某種天然防腐劑應用于魚肉制品中，或將幾種天然防腐劑復合使用，且全部基于經驗或根據傳統的抑菌譜實驗（濾紙片法、稀釋法、杯碟法、濁度法等）確定配方。上述方式具有明顯的缺陷，例如由于魚肉制品中的大部分微生物是不可培養的[8]，用傳統的微生物分離及培養方法不可能確知魚肉制品體系的腐敗菌菌相，且上述抑菌譜實驗對目前可分離、培養的微生物并沒有完全涵蓋，因此不能全面了解配方中各成分的防腐效果，也不能配制出針對性強、效力高的復合天然防腐劑。以基因（組）多樣性反映物種多樣性的聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，

PCR-DGGE）技術可靠性和重現性較好、方便快捷[9-10]，

可以比較全面客觀地展現整個菌群多樣性的動態變化。國內外已有研究將該方法用于鯽魚[11]、三文魚[12]、

草魚[13]及其他魚肉制品[14-16]中微生物的分析，但我國對于生鮮羅非魚片防腐保鮮方面的研究鮮有報道。本研究應用PCR-DGGE技術研究8 種天然防腐劑對生鮮羅非魚片上腐敗菌生長代謝的影響，合理組合不同防腐劑，針對性地抑制羅非魚片中微生物的生長，研制生鮮羅非魚片專用天然防腐劑，以延長產品的保質期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮羅非魚片 茂名市海名威水產科技有限公司。

細菌基因組DNA快速提取試劑盒 廣州東盛生物科技有限公司；DNA Marker DL2000 德國Newgene Biotechnology公司；Go Taq Green Master Mix（2×） 美國Promega公司；溴化乙錠（ethidium bromide，EB）、6×上樣緩endprint

沖液 北京中生瑞泰科技有限公司；Goldview染料（含量≥95%） 上海范柏實業有限公司。

1.2 儀器與設備

2001-220DGGE電泳儀 美國CBS Scientific公司；Gel-Dol 2000凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；T196DNA擴增儀 德國Biometra公司；DYCP-31CN水平電泳儀 北京六一儀器廠；TPX-20MC紫外觀測臺 法國Vilber Lourmat公司；DSHZ-300A旋轉式恒溫振蕩器 太倉市實驗設備廠；TL-MM-1微量振蕩器 廣州云薈貿易有限公司；SW-CJ-1FDA超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；YX-280A手提式壓力蒸汽滅菌器 合肥華泰醫療設備有限公司；PB-10 pH計 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；E-201-C-9復合電極 上海精密科學儀器有限公司；7250紫外分光光度計 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 8 種天然防腐劑的配制

新鮮大蒜、生姜榨汁，過濾后得清液為原汁，用無菌蒸餾水稀釋原汁，分別配制成體積分數為20%和60%的溶液；稱取殼聚糖0.4、1.2、2.0 g，分別用1%醋酸溶液溶解、定容至100 mL，用稀氫氧化鈉溶液調節pH值至6.2；稱取茶多酚、Nisin、魚精蛋白、ε-聚賴氨酸各0.2、0.6、1.0 g，分別用無菌蒸餾水溶解、定容至100 mL；稱取溶菌酶0.1、0.3、0.5 g，分別用無菌蒸餾水溶解、定容至100 mL。

1.3.2 8 種天然防腐劑最佳防腐濃度的確定

將生鮮羅非魚片分別浸泡在不同濃度的8 種天然防腐劑溶液中5 min，瀝干后置于4 ℃冰箱中，定期取樣進行菌落總數和總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量的測定，確定不同防腐劑的最佳防腐濃度。以浸泡無菌蒸餾水的魚片作為對照。

1.3.3 生鮮羅非魚片的PCR-DGGE分析

用最佳防腐濃度的8 種天然防腐劑分別浸泡生鮮羅非魚片5 min，瀝干后置于4 ℃冰箱中，冷藏6 d時取樣進行PCR-DGGE分析。以浸泡無菌蒸餾水的魚片作為對照。

1.3.4 復合天然防腐劑的防腐效果研究

根據抑菌譜結果，針對性地將幾種天然防腐劑按一定比例進行復配，將生鮮羅非魚片在復合天然防腐劑中浸泡后，4 ℃貯藏，定期取樣分析。

1.3.5 指標測定

菌落總數測定：按照GB 4789.2—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[17]；TVB-N值測定：按照GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛生標準的分析方法》[18]中的微量擴散法進行測定。

1.3.6 PCR-DGGE分析

DNA提?。涸跓o菌操作臺用無菌剪刀剪取魚肉10 g于滅菌錐形瓶（內有10 g 玻璃珠和90 mL生理鹽水）中，搖床振蕩30 min，靜置后取20 mL上清液于無菌離心管中，10 000 r/min離心20 min，得菌體沉淀。按試劑盒說明書提取細菌DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR擴增：參照孟曉華等[19]的方法，采用巢氏PCR擴增細菌DNA的16S rDNA的V3可變區。第1輪擴增大小約為800 bp的細菌16S rDNA序列，引物為8F/798R，由上海捷瑞生物工程有限公司合成[20]。擴增體系：Go Taq Green Master Mix（2×）12.5 μL、引物各1 μL、模板2 μL、ddH2O 8.5 μL。擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，25 個循環；最后72 ℃延伸2 min。第2輪擴增細菌16S rDNA的V3區片段，引物為GC 338F/518R[21-22]，以第1輪PCR擴增產物為模板，用降落PCR進行擴增。擴增體系：Go Taq Green Master Mix（2×）25 μL、引物各1 μL、模板1 μL、ddH2O 22 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min，然后使用降落PCR程序[23]，20 個循環（94 ℃變性1 min；退火溫度從65 ℃到55 ℃，退火30 s；72 ℃延伸3 min），再于恒定退火溫度下進行10 個循環（94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min），最后72 ℃再延伸10 min。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

DGGE分析：采用質量濃度為80 g/L的聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為40%～60%（100%變性劑：7 mol/L尿素+

體積分數40%的甲酰胺），在1×TAE（三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸，tris base-acetic acid-EDTA，TAE）緩沖液中，60 ℃、150 V條件下電泳5 h。膠片用含0.5 mg/L EB的1×TAE緩沖液染色，用凝膠成像系統進行拍照和圖像分析。

條帶回收和測序：參照Toffin等[24]的方法，在紫外觀測臺上切下膠片各泳道的主要條帶，溶于30 μL ddH2O中，搗碎、混勻，置于4 ℃條件下過夜。以10 μL回收DNA溶液為模板，用338F（無GC夾）/518R引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳測定產物的產量及特異性。采用割膠純化法對PCR產物進行純化，將純化后的PCR產物連接到pMD18-T載體上，轉化DH5α細胞，對陽性克隆株進行測序。DNA測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，測序后獲得的細菌16S rDNA序列，登錄NCBI網站進行查詢和比對[25]。

1.4 數據處理

使用Excel 2003軟件進行數據整理和繪圖，SAS軟件進行方差分析。樣品均平行測定3 次，結果以平均值±標準差表示。endprint

2 結果與分析

2.1 不同濃度的8 種天然防腐劑的防腐效果比較

由表1可知，經不同濃度和種類防腐劑處理的羅非魚片冷藏過程中的菌落總數和TVB-N值均低于對照組，說明8 種天然防腐劑對羅非魚片均有一定的防腐效果，且8 種天然防腐劑的最佳防腐濃度分別為生姜溶液20%、大蒜溶液60%、溶菌酶0.5 g/100 mL、茶多酚0.6 g/100 mL、nisin 1.0 g/100 mL、魚精蛋白0.6 g/100 mL、殼聚糖1.2 g/100 mL、ε-聚賴氨酸0.6 g/100 mL。

2.2 生鮮羅非魚片上腐敗菌的PCR-DGGE分析

1. 對照；2. Nisin；3. 茶多酚；4. ε-聚賴氨酸；5. 魚精蛋白；

6. 殼聚糖；7. 生姜溶液；8. 大蒜溶液；9. 溶菌酶。

DGGE圖譜上的不同條帶代表不同的細菌，條帶的亮度則反映細菌的數量，條帶越亮表示細菌的數量越多[21]。由圖1可知，不同種類的天然防腐劑對羅非魚片上細菌生長的影響不同。切割圖1中各電泳條帶進行測序的結果如表2所示，8 種不同種類的天然防腐劑對DGGE條帶對應相似菌株生長情況的影響如表3所示。

2.3 復合天然防腐劑的防腐效果

根據8 種天然防腐劑抑菌譜互補的原則，優選生姜、大蒜、殼聚糖和魚精蛋白4 種天然防腐劑，按比例復配（20%生姜溶液、20%大蒜溶液、0.6 g/100 mL魚精蛋白、1.2 g/100 mL殼聚糖）后，浸泡羅非魚片，研究復合天然防腐劑的防腐效果。以浸泡無菌蒸餾水的魚片作為對照。

1. 對照組，貯藏0 d（未腐?。?. 對照組，貯藏9 d（開始腐敗）；3. 對照組，貯藏15 d（嚴重腐?。?；4. 復合天然防腐劑處理組，貯藏9 d（未腐?。?；5. 復合天然防腐劑處理組，貯藏15 d（開始腐?。?；6. 復合天然防腐劑處理組，貯藏21 d（嚴重腐?。?。

由圖2可知，與對照組相比，經復合天然防腐劑處理的魚片感官品質下降較為緩慢。對照組魚片的TVB-N值和菌落總數顯著高于復合天然防腐劑處理組（P<0.05），冷藏9 d時對照組魚片的TVB-N值達21.2 mg/100 g，超過國家限量標準（20 mg/100 g）[26]，而冷藏15 d時復合天然防腐劑處理組魚片的TVB-N值僅為18.69 mg/100 g。冷藏9 d時對照組魚片的菌落總數和冷藏15 d時復合天然防腐劑處理組基本持平。可見，復合天然防腐劑能有效抑制羅非魚片TVB-N值和菌落總數的升高，從而有效延長羅非魚片的保質期。

由圖3和表4可知，與1號泳道相比，4號泳道沒有a、b條帶；與2號泳道相比，5號泳道沒有b、d條帶，且e、f、g條帶亮度較弱；與3號泳道相比，6號泳道各條帶亮度較弱；1、2、3號泳道的c、d、e、f、g條帶亮度依次增強，4、5、6號泳道的c條帶亮度依次增強，a條帶從無到有。這表明復合天然防腐劑處理組羅非魚片與對照組相比，其菌相構成在冷藏的各個階段均存在較大差異。對照組魚片中細菌種類較多，且各類細菌的數量隨冷藏時間的延長逐漸增多，而復合天然防腐劑處理組魚片的假單胞菌數量明顯比對照組少，且菌相構成較為單一。研究表明，有氧低溫冷藏（0～15 ℃）淡水魚的特定腐敗菌是假單胞菌，而寒帶和溫帶海域魚類有氧冷藏過程中的特定腐敗菌是耐冷的革蘭氏陰性假單胞菌和（或）希瓦氏菌[27-28]。本研究結果表明，復合天然防腐劑能有效抑制羅非魚片中的大部分細菌，且對導致羅非魚片腐敗的特定腐敗菌假單胞菌也有一定的抑制作用。綜合感官品質、TVB-N值和菌落總數的變化可知，復合天然防腐劑能夠有效地將生鮮羅非魚片的保質期延長至15 d以上，而不使用防腐劑的生鮮羅非魚片保質期僅為9 d。

3 結 論

本研究以TVB-N值和菌落總數為指標，結合PCR-DGGE技術研究8 種天然防腐劑對生鮮羅非魚片中腐敗菌生長的影響，并根據8 種天然防腐劑抑菌譜互補的原則配制出羅非魚片專用的復合天然防腐劑，配方為20%生姜溶液、20%大蒜溶液、0.6 g/100 mL魚精蛋白、1.2 g/100 mL殼聚糖，按此配方配制的復合天然防腐劑能夠有效抑制羅非魚片中腐敗菌的生長，使貯藏在4 ℃有氧冷藏條件下的生鮮羅非魚片的保質期延長至15 d以上。本研究中的復合天然防腐劑能夠實現對樣品中腐敗菌的靶向抑制，且能夠快速復配，高效、安全。

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