紅曲菌種的活化復壯與紅曲的培養

宋淑芬，柳忠玉，馬立安,2*

(1.長江大學 生命科學學院，湖北 荊州 434025；2.長江大學荊楚特色食品研發中心，湖北 荊州 434025)

紅曲菌種的活化復壯與紅曲的培養

宋淑芬1，柳忠玉1，馬立安1,2*

(1.長江大學 生命科學學院，湖北 荊州 434025；2.長江大學荊楚特色食品研發中心，湖北 荊州 434025)

紅曲米中分離純化得到的50株菌株，經優化獲得1株高產淀粉酶的Ap16優勢菌株，根據Ap16菌株的形態特征和ITS序列鑒定為紫色紅曲霉。然后對Ap16進行三角瓶密封復壯和瓷盤敞開式復壯，測定其含水量和色價，綜合得出Ap16在大米與糯米以6∶1的比例混合在三角瓶密封復壯條件下，色價值較高，為紅曲霉的進一步研究及工業化生產應用提供了依據。

紫色紅曲霉；篩選；優化；復壯

紅曲又稱紅曲米，是大米經紅曲霉發酵而成，是一種可食用的天然色素，可用于釀酒、制醋、做豆腐乳的著色劑和調味劑[1]。據不完全統計，我國目前已知的天然色素有80多種[2]，西方一些發達國家在食品中使用天然色素的比例已達85%，且有完全取代合成色素的趨勢[3]，天然色素與人工合成色素相比有無毒、安全性高、色澤自然鮮艷的特點[4,5]，具有防腐作用和抗氧化活性，并有很高的營養價值和藥理功能等優越性[6,7]。鑒于目前紅曲的復壯方法報道較少，紅曲菌種易馴化，產量不穩定等問題，為了保證其菌種純度高、生命活力旺盛，并具有獨特性的優良性狀，在引用和保存時要對菌種進行復壯，淘汰老化、退化及劣質菌種[8,9]，復壯的目的是確保菌株的優良性狀、菌種的純度、防止菌株的退化。本文通過篩選得到1株優良、高產色素的紅曲菌株，然后進行復壯培養基的研究，為進一步開發應用紅曲奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料

紅曲：實驗室保存菌種；麩皮：新鮮、無蟲蛀、無霉變；土豆：新鮮、無腐爛、無霉變；大米：新鮮、無蟲蛀、無霉變；糯米：新鮮、無蟲蛀、無霉變。

1.1.2 設備

HH-4恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；TU-1990分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；TE3102S電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；HVE-50高壓滅菌器 華粵企業集團有限公司；HFsafe-1200超凈工作臺 上海力申科學儀器有限公司；SPX-250生化培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；ChemStar ATS-O3M2數控恒溫搖床 上海堪鑫儀器設備有限公司；小型臺式高速冷凍離心機 德國艾本德公司；BIO-RAD Mycycler PCR儀、BIO-RAD POWER PAC200電泳儀、BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統 美國Bio-Rad(伯樂)公司；VORTEX-5旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；400A手提式粉碎機 廣州國偉機械設備有限公司。

1.2 培養基

PDA培養基[10]：另加2 mL慶大霉素。

淀粉培養基[11,12]：可溶性淀粉30 g，蛋白胨20 g，K2HPO42 g，MgSO40.5 g，KCl 0.5 g，酵母粉1 g，瓊脂20 g，自來水1 L，pH 5.0～6.0。

種子培養基[13,14]：可溶性淀粉1 g，蛋白胨1 g，NaCl 1 g，自來水1 L，pH自然。

發酵培養基：可溶性淀粉3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，牛肉膏3 g，自來水1 L，pH自然。

復壯培養基：①大米與糯米混合物，冰醋酸(1.8 mL/500 g)，紅曲霉(10 g/500 g)；②麩皮，冰醋酸、紅曲霉添加量同①；③大米，冰醋酸、紅曲霉添加量同①。

1.3 主要試劑和溶液配制

DNS試劑[15,16]：3，5-二硝基水楊酸3.15 g，加蒸餾水500 mL，攪拌均勻45 ℃水浴，然后加入100 mL 0.2 g/mL的NaOH，充分攪拌，直到溶液清澈透明。再依次加入四水酒石酸鉀鈉91.0 g、苯酚2.50 g和無水亞硫酸鈉2.50 g。繼續45 ℃水浴加熱，補加水300 mL，充分攪拌，直到加入的物質完全溶解。冷至室溫后，用蒸餾水定容到1000 mL。過濾后取濾液，儲存在棕色瓶中，避光保存備用。

磷酸氫二鈉標準液：磷酸氫二鈉71.628 g，定容到1000 mL。

檸檬酸標準液：檸檬酸21.014 g，定容到1000 mL。

檸檬酸-磷酸氫二鈉(pH 5.6)：磷酸氫二鈉標準液11.60 mL，檸檬酸標準液8.40 mL。

10% CTAB：于250 mL燒杯中加入180 mL去離子水，溶解20 g CTAB，加水定容至200 mL，分裝備用。

5 mol/L NaCl：稱取73.05 g氯化鈉，分幾次加入到200 mL去離子水中，用磁力攪拌器攪拌溶解，待完全溶解后，加水定容至250 mL，分裝后滅菌。

1 mol/L Tris-HCl：稱取30.275 g Tris溶于200 mL去離子水中，加入10 mL左右濃鹽酸，調節pH至8.0，待溶液冷卻至室溫后，再次對pH做適當的調節，使pH最終在8.0，補足水量到250 mL，分裝后滅菌。

0.5 mol/L EDTA：稱取46.525 g Na2EDTA·2H2O置于500 mL燒杯中，加入200 mL雙蒸水，充分攪拌，加入7 g固體NaOH使pH至8.0，加入雙蒸水定容到250 mL，適量分裝成小份，高溫高壓滅菌。

1.4 方法

1.4.1 紅曲培養的工藝流程

優選大米或糯米→浸泡→洗浸→加適量水與冰醋酸→高壓滅菌→冷卻→接紅曲菌種→恒溫培養→拌曲→晾干→成品。

1.4.2 紅曲霉菌株的分離純化

將稱取的10 g紅曲米用無菌研缽研碎后倒入90 mL無菌水中，在30 ℃，180 r/min條件下搖20 min，用接種環在PDA上劃線，30 ℃培養2天，待長出白色絨毛狀菌絲，用尖鑷子挑取單個菌落轉接于另一PDA平板上繼續培養1周，得到50株分離純化紅曲霉菌株。

1.4.3 紅曲霉菌株的初篩

透明圈法：在每支試管中裝18 mL淀粉培養基，經高壓滅菌后，倒入滅菌的平皿中。將分離純化得到的50株紅曲霉制作成菌餅轉接到淀粉培養基上，30 ℃培養1周后加碘液染色，然后測量紅曲霉菌落透明圈大小和菌落直徑大小，計算Aa/A0的比值，將其作為紅曲霉菌株酶活性大小的初篩指標，然后進行復篩。

1.4.4 紅曲霉菌株的復篩

1.4.4.1 紅曲霉菌株淀粉粗酶液的制備

將初篩Aa/A0比值較大的5株紅曲霉菌株先接入種子培養基，在35 ℃，180 r/min下培養3天，然后取1 mL孢子懸浮液轉接入發酵培養基，在35 ℃，180 r/min下培養1周后，發酵液用1000 r/min離心10 min，取上清液即為淀粉粗酶液。

1.4.4.2 紅曲霉菌株淀粉酶活的檢測

將2 mL 5%可溶性淀粉和2 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液依次加入20 mL具塞比色管中，40 ℃水浴10 min，然后加1 mL粗酶液，繼續水浴1 h，加入2 mL DNS終止反應，搖勻后放入沸水浴煮沸5 min，冷卻至室溫，用蒸餾水定容到20 mL，以不加酶液的做對照，在520 nm波長下，迅速測定反應液的吸光值。

1.4.4.3 紅曲霉菌株的酶活計算

淀粉酶酶活的定義：在以上反應條件下，1 min釋放1 μg葡萄糖的酶量定義為1個活力單位。

參照葡萄糖標準曲線(見圖2)，根據淀粉酶活定義計算不同紅曲霉菌株產淀粉酶的酶活。

1.5 紅曲霉的測序

將優選菌種在PDA上培養1周后，觀察菌落特征和顯微特征，同時用CTAB法提取DNA，然后進行PCR擴增。擴增后采用Cycle Pure Kit PCR產物純化回收試劑盒回收PCR產物，送武漢生物公司測序。

1.6 紅曲霉的復壯

1.6.1 糯米和大米混合復壯紅曲霉

將優選糯米與大米按1∶1(B1)，1∶2(B2)，1∶3(B3)，1∶4(B4)，1∶5(B5)，1∶6(B6)的比例稱取30 g(2個平行)，浸泡2 h，瀝干水分后加水適量，冰醋酸0.1 mL，塞好棉塞，121 ℃滅菌25 min，待冷卻至室溫后，接種優選菌種。每隔1天用玻璃棒攪拌1次，直到米粒完全打散以后不需攪拌，直接晃動三角瓶，培養7天后米粒完全長好。

1.6.2 三角瓶復壯紅曲霉

稱取大米30 g，浸泡2 h，瀝干水分后同1.6.1，標為C1(2個平行)。

稱取麩皮過篩，水洗去除淀粉，擰干至有水出而不下滴，冰醋酸0.1 mL，塞好棉塞，121 ℃滅菌40～45 min，同上1.6.1，標為C2(2個平行)。

1.6.3 瓷盤復壯紅曲霉

篩選1.6.1與1.6.2中較好的培養基繼續進行瓷盤復壯，瓷盤復壯又分為不淋水D1(大米)、D2(大米糯米混合物)，淋水D3(大米)、D4(大米糯米混合物)進行培養，每天適量地加水攪拌混勻，培養7天后紅曲霉完全長好，然后對4個樣品進行分析比較。

1.7 紅曲米色價的測定

參照國標GB 1886.19-2015[17]將以上復壯的B6，C1，D1，D2，D3，D4用碎粹機粉碎，過40～60目篩。稱取混合均勻樣品0.2 g(精確至0.001 g)，70%乙醇溶液溶解并將其轉入100 mL容量瓶中，定容到刻度，放入60 ℃水浴中，準確浸泡1 h，取出冷卻至室溫，補充70%乙醇溶液到刻度，混勻。然后過濾，將濾液收集于具塞比色管中，備用。

準確吸取上述濾液2.0～5.0 mL于50 mL容量瓶中(使最終稀釋液吸光度在0.3～0.6范圍內)，用70%乙醇溶液稀釋定容到50 mL，搖勻，以70%乙醇溶液為對照，在波長505 nm下，測定試樣浸泡稀釋液的吸光度A。

色價X1(U/g)，按公式(1)計算：

公式(1)

式中：A為浸泡稀釋液的吸光度；100為換算系數；m1為稱取樣品的質量，g；50為換算系數；V為吸取乙醇浸泡液的體積，mL。

2 結果與分析

2.1 產淀粉酶菌初篩

根據1.4.3的方法將PDA上分離得到的50株紅曲霉轉接到淀粉培養基上，30 ℃培養1周后加入碘液染色，測量紅曲霉菌株透明圈大小和菌落直徑大小，計算Aa/A0的比值。5株Aa/A0比值較高的菌株見表1。其中編號為Ap16的菌株透明圈最大，Aa/A0比值為0.3191，見圖1。

表1 5株紅曲霉菌株透明圈的比值

圖1 Ap16在淀粉培養基上生長1周后的菌落與透明圈

2.2 產淀粉酶菌株的復篩

根據1.4.4的方法將5株紅曲霉菌株的發酵培養液離心得到粗酶液，通過檢測比較5株紅曲霉的淀粉酶酶活大小，最終篩選出淀粉酶活性較高的Ap16菌株，根據圖2算出Ap16菌株淀粉酶活可達132～142 U/mL。

圖2 葡萄糖標準曲線

2.3 Ap16菌株的形態特征及鑒定

菌落特征：PDA培養基的菌落3天前為白色絨毛狀，4天后中心菌絲開始變為紅色，培養14天后變為紅色，菌落直徑68.16 cm，在淀粉培養基上培養7天后，菌落直徑第3天開始慢慢出現輻射狀，第4天呈現均勻輻射狀的裂紋，中心呈紅色，正面從里到外顏色均為紅色，微微隆起，見圖3。

圖3 Ap16菌株在PDA上生長14天菌落正面

顯微特征：顯微鏡觀察菌絲光滑，有隔膜，直徑4～6 μm的分支狀，有深淺不一的紅色色素顆粒，分生孢子球形，直徑5～7 μm，壁囊殼呈球形，透明淡紅色或無色，棉蘭染色見圖4。

圖4 Ap16的菌絲、分生孢子及閉囊殼

2.4 紅曲霉測序結果

經過ITS測序得出其長度為574 bp(見圖5)，其同紫色紅曲霉的相似度達99%。

圖5 Ap16菌株ITS基因序列(574 bp)

圖6 基于ITS建立的紅曲霉系統發育樹

根據形態特征、顯微特征和ITS基因分析將Ap16菌株鑒定為紫色紅曲霉。

2.5 紅曲霉菌株的復壯

2.5.1 糯米與大米混合三角瓶復壯的分析

根據1.6.1的方法將普通糯米與大米按1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6的比例培養1周后，結果見圖7。

圖7 糯米與大米混合培養1周后結果

注：左上依次為B1，B2，B3；左下依次為B4，B5，B6。

由圖7可知，B1中的紅曲米米粒黏稠，顏色紅色，有部分沒長紅。B2米粒較松散，顏色紅色，些許米粒未長紅。B3紅曲米米粒松散，顏色深紅，少許幾粒米粒沒長紅，捏碎時米粒很軟，橫斷面中心沒全紅。B4紅曲米米粒松散，顏色深紅，捏碎時米粒較軟，橫斷面中心全紅。B5紅曲米米粒松散，顏色深紅，捏碎時米粒略干，橫斷面中心位置全紅。B6紅曲米米粒松散，顏色深紅，捏碎時米粒較干，橫斷面中心位置全紅。然后根據國標GB 5009.3-2010[18]測定B1～B6的紅曲米含水量，結果見表2。

表2 糯米與大米混合復壯的含水量結果分析

由表2可知，隨著糯米添加量的減少，紅曲米長成后期水分含量也隨之降低，說明紅曲米培養前期加入適量的糯米可以保證紅曲霉生長所需的水分，按B6的比例培養得到的紅曲米效果較好。

2.5.2 大米與麩皮三角瓶復壯的分析

根據1.6.2的方法將大米復壯(C1)和麩皮復壯(C2)的紅曲霉培養1周后，結果見圖8。

圖8 大米復壯和麩皮復壯的紅曲霉培養1周后結果

注：從左至右依次為C1，C2。

由圖8可知，麩皮復壯的紅曲霉呈紅色，但顏色不深，大米復壯的紅曲霉呈深紫色，橫斷面呈現深紅色，其含水量的測定見表3。

表3 大米與麩皮復壯的含水量結果

由表3可知，大米和麩皮復壯紅曲霉其含水量相差較大，麩皮復壯后較干燥，效果較好，但由圖8復壯的顏色來看，卻不是很理想。綜合得出大米復壯的效果較好。

2.5.3 瓷盤復壯的分析

根據1.6.3的方法將瓷盤復壯紅曲霉培養1周后，結果見圖9。

圖9 瓷盤復壯紅曲霉培養1周后結果

注：左上依次為D1，D2不淋水培養；左下依次為D3，D4淋水培養。

由圖9可知，D1，D2是不淋水復壯的，D3，D4是淋水復壯的，對4個樣品進行對比，可以明顯看出淋水后的米粒復壯后的顏色更深，其含水量的測定見表4。

表4 瓷盤復壯的含水量結果

由表4可知，淋水復壯的含水量比不淋水復壯的含水量高，不淋水復壯的米粒很干燥，但由圖9復壯的顏色來看，卻不是很理想，綜合得出淋水復壯的效果較好。

2.6 紅曲霉色價分析

將上述B6，C1，D1，D2，D3，D4按照國標GB 1886.19-2015測色價的方法得出結果，見表5。

表5 幾種樣品色價分析結果

由表5可知，三角瓶密封情況下復壯的色價值較高，瓷盤敞開式復壯的色價較低。而瓷盤敞開式淋水復壯又比不淋水復壯的色價要高。大米與糯米混合復壯又比大米單獨復壯的色價略好，可以得出復壯前期糯米可以給紅曲提供適量的水分，保證紅曲的正常生長。

3 結論

本研究經分離純化篩選得到高產淀粉的Ap16，根據ITS基因測序鑒定為紫色紅曲霉。培養后，檢測Ap16淀粉酶活可達132～142 U/mL。此外，不同復壯方式對后期紅曲霉產色素的能力有很大影響，密封培養的紅曲霉色價值比敞開式要好，而且大米與糯米混合比大米單獨生長的色價要好。

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ActivationandRejuvenationofMonascusStrainsandCultureofMonascus

SONG Shu-fen1, LIU Zhong-yu1, MA Li-an1,2*

(1.College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, China;2.Jingchu Special Food Research and Development Center,Yangtze University, Jingzhou 434025, China)

To obtain aMonascusstrain which has high-efficiency degradation for starch, 50Monascusstrains are separated and purified from red yeast rice. Ap16 which has high-yield amylase is obtained through screening. According to the morphological characteristics and ITS gene sequence of the strain Ap16, it is identified asMonascuspurpureus. And then the triangular flask sealing rejuvenation and china plate open rejuvenation for Ap16 is carried out, the water content and color value are determined, it can be concluded that the Ap16 mixed with rice and glutinous rice (the ratio of 6∶1) under the conditions of triangular flask sealing rejuvenation has higher color value. The results have provided a basis for further research and industrial application ofMonascus.

Monascuspurpureus；screening；optimization；rejuvenation

TS201.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.004

1000-9973(2017)11-0018-06

2017-05-21 *通訊作者

宋淑芬(1993-)，女，湖北孝感人，碩士，主要從事食品微生物與生態學方面的研究。