發酵處理對兔肉醬營養與品質的影響

王 東

(常州旅游商貿高等職業技術學校，江蘇 常州 213032)

發酵處理對兔肉醬營養與品質的影響

王 東

(常州旅游商貿高等職業技術學校，江蘇 常州 213032)

文章以野兔肉為原料，研究不同的發酵處理對發酵兔肉醬游離氨基酸和脂肪酸組成及含量的影響，對于認識其營養價值和風味起著重要作用，也是評價發酵制品的營養標準之一，同時為發酵兔肉醬的品質控制和開發提供理論依據。

兔肉醬；發酵處理；游離脂肪酸；游離氨基酸；營養；風味

兔肉中含有豐富的蛋白質，蛋白質在發酵過程中在微生物作用會發生降解，形成多肽和各種游離氨基酸。氨基酸是人體生命活動的重要物質，它具有各種生理功能。而且在食品的呈味方面，氨基酸扮演著十分重要的角色，氨基酸作為多官能團的小分子，能與多種味覺受體作用，味感豐富，不同的氨基酸組合會產生多種復雜的滋味。而且氨基酸還是許多風味物質的前體，可賦予產品特殊的風味，對改善產品的整體風味有著不可替代的重要貢獻。游離氨基酸在微生物發酵劑的作用下，制品的游離氨基酸含量會有不同程度的增加，而且不同的微生物發酵劑對制品的游離氨基酸含量的增加程度也不一樣[1-3]。

脂肪在發酵過程中受脂肪酶的作用水解產生游離脂肪酸，游離脂肪酸是脂肪水解的主要產物之一，它不僅是衡量脂肪水解程度的重要指標，而且為后續的脂肪氧化提供了底物。游離脂肪酸通過氧化作用可生成醇、醛及酮等小分子化合物，賦予發酵產品特有的風味。因此，游離脂肪酸的產生和積累在很大程度上影響著肉制品的品質。此外，脂肪酸的種類和數量與人體健康密切相關。

目前國內外學者對游離氨基酸的研究主要集中在火腿、香腸等肉制品以及豆醬、醬油等豆制品中，對金華火腿、臘腸等制品的游離脂肪酸研究也較多[4,5]，而關于微生物發酵劑接種發酵對野兔肉游離氨基酸和脂

肪酸組成和含量的分析還未見報道。

1 材料與方法

1.1 原材料及菌種

菌種：植物乳桿菌L21、葡萄球菌C5；

原料：無土腥味野兔肉，由鹽城市食為天野兔專業合作社提供；

輔料：葡萄糖、蔗糖，A.R.級；食鹽、脫皮芝麻、香辣醬、豆豉，均為市售食品級。

1.2 主要試劑

濃鹽酸、NaCl：優級純；混合氨基酸標準液：日立公司提供；檸檬酸鈉緩沖液(pH分別調節為2.2，3.3，4，6.4)；茚三酮溶液、苯酚、甲醇、苯、氯仿、丙酮、三氟化硼、高純氮：均為分析純；正己烷：色譜純；Amberlyst-26樹脂。

1.3 主要儀器與設備

Agilent 1100高效液相色譜儀 美國 Agilent 公司；日立835-50型氨基酸自動分析儀 日本日立公司；Trace GC Ultra氣相色譜儀、Trace DSQ II 氣相色譜-質譜聯用儀 美國Thermo公司；HH-8數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司； SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；HSX-250型恒溫恒濕培養箱 上海福瑪實驗設備有限公司；YX280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫療器械有限公司；DHG-9148A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 發酵兔肉醬樣品的制備

1.4.1.1 基本配方

兔肉，蔗糖0.5%，葡萄糖0.5%，食鹽2.5%，水12%，豆豉4%，脫皮芝麻2%，四川香辣醬4%。

1.4.1.2 制作方法

兔肉解凍→預處理→絞碎→拌料(加蔗糖、葡萄糖、食鹽和水)→接種→發酵→拌料(加豆豉、芝麻和香辣醬)→真空包裝(高溫蒸煮袋)→滅菌→成品。

1.4.1.3 發酵劑菌液制備

對篩選菌株進行糖類發酵試驗，采用生化反應管檢驗，通過觀察菌株對各種糖的利用情況確定其屬種。將待鑒定菌株接種于生物反應管后30 ℃培養24 h，觀察培養基的顏色是否變化，若變為黃色，則為陽性，表明可發酵該糖并產酸。

1.4.2 操作要點

兔肉預處理：將冷凍兔肉置于室溫下解凍約4 h，清洗，去筋膜，絞碎。

接種發酵：肉糜中加入蔗糖、葡萄糖、食鹽和水，混勻，添加發酵劑，再混勻攪拌。

發酵：密封，避光，于適宜條件下發酵。

拌料：發酵完成后，添加豆豉、芝麻和香辣醬等調味制醬。

包裝滅菌：將發酵成熟的兔肉放入耐高溫的包裝袋中，真空包裝，封口，高壓鍋121 ℃滅菌20 min，同時起到熟化肉醬的作用。

1.4.3 游離氨基酸含量的測定

依據GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》方法，用日立835-50型氨基酸自動分析儀測定各處理樣品中游離氨基酸的含量。準確稱取一定量勻漿后的樣品于水解管中，加入6 mol/L鹽酸約10～15 mL，加入重蒸餾的苯酚4滴，將水解管置于冷凍劑中冷凍3～5 min，抽真空后充入氮氣，在氮氣保護下封口，于110 ℃恒溫干燥箱內水解22 h。冷卻后將水解液過濾，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液移入50 mL容量瓶中并定容。取濾液1 mL至5 mL容量瓶中，在40～50 ℃下用真空干燥器干燥，用l～2 mL水溶解，再干燥，蒸干，最后用pH 2.2的緩沖液溶解。用外標法上機測定制備好的試樣測定液中各氨基酸的含量。

1.4.4 游離脂肪酸含量的測定

1.4.4.1 總脂的提取

用三氯甲烷-甲醇混合液(V/V，2∶1)水浴加熱提取脂肪[6]。

1.4.4.2 樹脂的處理、再生和保存

取Amberlyst-26樹脂10 g于錐形瓶中，加入0.5 mol/L的NaOH溶液100～200 mL，振蕩30 min后，傾去溶液，先后用蒸餾水和甲醇分別洗滌3次，每次振蕩20 min，保存于甲醇中。

1.4.4.3 游離脂肪酸的分離[7]

稱取50～100 mg脂肪于具塞三角瓶中，加入15 mL丙酮-甲醇溶液(V/V，2∶1)，再加入100～200 mg樹脂，振蕩30 min后傾去溶劑，再用15 mL丙酮-甲醇溶液分4次將樹脂洗入具塞試管，傾去溶劑后以氮氣吹干樹脂。加入甲酯化試劑 [BF3-CH3OH(W/V，14%)、苯、甲醇為1∶1∶1] 3 mL，加塞，沸水浴30 min，冷卻后加入正己烷2 mL和蒸餾水1 mL，混勻后靜置分層。吸取上層正己烷1 μL進行氣相色譜分析。

1.4.4.4 游離脂肪酸的測定

氣譜條件：毛細管柱為SupelcowaxTM10，柱長30 m，內徑0.25 mm，膜厚0.25 μm(涂層為polyethyleneglycol)。進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度260 ℃；載氣：氮氣；載氣流速：1.2 mL/min；分流流速：22 mL/min；分流比：20∶1；尾吹氣：氫氣，32 mL/min；空氣，430 mL/min；柱升溫程序：初溫80 ℃，以20 ℃/min升至210 ℃，再以3 ℃/min升至225 ℃，保持12 min。

質譜條件：離子源為EI源，離子源溫度為230 ℃；接口溫度為250 ℃，四級桿溫度為150 ℃，倍增器電壓為1345 V，發射電流為34.6 μA，掃描范圍為20～500 amu，電離電壓為70 eV，溶劑延遲2 min。

檢測得到游離脂肪酸總離子流圖，將質譜數據與計算機標準圖譜庫進行比較，根據檢索結果及相關參考文獻進行定性。采用峰面積歸一化法進行定量，以確定各種脂肪酸的相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 發酵處理對兔肉醬游離氨基酸的影響

2.1.1 不同處理對兔肉醬游離氨基酸影響的比較

表1 不同處理游離氨基酸的含量Table 1 Free amino acids content among treatments g/100 g

注：L為乳酸菌單菌發酵組，C為葡萄球菌單菌發酵組，S為混合發酵組，CK為空白對照組。

游離氨基酸的含量變化直接影響到產品的風味。由表1可知，添加發酵劑的兔肉醬中多種游離氨基酸及氨基酸的總量與對照組相比都增加了，其中混合發酵劑的作用效果最為明顯，游離氨基酸總量較對照組增加了約50%。說明發酵劑在發酵過程中對蛋白質的水解起到了促進作用，這與很多研究的結果一致[8]。葡萄球菌在與乳酸菌共存時能正常生長，并積極促進肌肉蛋白質的降解，生成大量游離氨基酸[9]。

混合發酵組各種游離氨基酸含量由高到低依次為：亮氨酸Leu>丙氨酸Ala>賴氨酸Lys>谷氨酸Glu>苯丙氨酸Phe>纈氨酸Val>蘇氨酸Thr>蛋氨酸Met>異亮氨酸Ile>天門冬氨酸Asp>甘氨酸Gly>脯氨酸Pro>組氨酸His>胱氨酸Cys>酪氨酸Tyr>絲氨酸Ser>精氨酸Arg，亮氨酸、丙氨酸、賴氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸在對照組和發酵組中都是含量最高的6種氨基酸，在混合發酵兔肉醬總氨基酸中分別占到15.28%，12.64%，10.99%，9.06%，9.03%，7.85%，這6種氨基酸可認為是發酵兔肉醬的特征性呈味物質。趙俊仁用自然發酵風干香腸中分離出來的彎曲乳桿菌、近平滑假絲酵母和木糖葡萄球菌接種發酵香腸發現混合接種發酵組的游離氨基酸顯著高于自然發酵組[10]。

有研究表明：產品在發酵過程中，蛋白質的分解和游離氨基酸的釋放受到微生物酶的作用[11]。結合本試驗的結果，適宜的發酵條件，不同微生物的共同作用，蛋白酶、肽酶等一系列分解蛋白質和多肽的酶發揮了積極作用，發酵的結果使各種游離氨基酸含量大大增加，對兔肉醬產品的風味有重要影響。

圖1 不同處理組各種游離氨基酸含量比較Fig.1 Comparison of free amino acids content among different treatments

由圖1可知，總體上接菌發酵組的游離氨基酸要高于對照組，而混合發酵組優于單菌發酵組?；旌习l酵組相對于對照組，游離氨基酸增加較明顯的8種分別是Leu，Ala，Lys，Phe，Asp，Met，Val，Thr。游離氨基酸根據其功能不同可分為必需氨基酸和非必需氨基酸，其中必需氨基酸包括Thr，Val，Met，Ile，Leu，Phe，Lys，His，非必需氨基酸包括Asp，Ser，Glu，Gly，Ala，Cys，Tyr，Arg，Pro。必需氨基酸中只有His的含量在不同處理組幾乎無差別。

2.1.2 呈味氨基酸的分類比較

為進一步探討發酵處理對制品游離氨基酸以及風味的影響，首先按照氨基酸呈味性質的不同將其分為：鮮味氨基酸(Asp，Glu)、甜味氨基酸(Ser，Ala，Thr，Gly)、苦味氨基酸(Val，Leu，Ile，His，Phe，Met)、甜味兼苦味氨基酸(Pro，Lys，Arg)等。

表2 呈味氨基酸分類比較Table 2 Classification comparison of DAA

由表2可知，與對照組相比，混合發酵兔肉醬的鮮味、甜味、苦味和甜味兼苦味氨基酸含量都有不同程度的增加。其中，鮮味氨基酸增加39.25%，甜味氨基酸增加72.85%，苦味氨基酸增加82.46%，甜味兼苦味氨基酸增加7.24%。甜味氨基酸和苦味氨基酸的增加量都較大，甜味兼苦味氨基酸增加相對較少，這些變化賦予混合發酵組大大優于對照組的豐富滋味。

2.1.3 混合發酵組呈味氨基酸分析

混合發酵兔肉醬制品中的不同呈味游離氨基酸見圖2，苦味氨基酸∶甜味氨基酸∶鮮味氨基酸∶甜味兼苦味氨基酸為3.30∶1.61∶1.02∶1，產品的感官風味良好，并未有苦味等異味，說明各呈味氨基酸按照一定比例組合有利于形成產品良好的滋味。對金華火腿獨特滋味體系的研究發現呈味游離氨基酸組成比例為苦味∶甜味∶ 鮮味∶甜味兼苦味氨基酸為2.85∶1.08∶0.77∶1[12]?；旌习l酵兔肉醬制品的呈味游離氨基酸中，雖然苦味氨基酸所占比例較大，但和其他呈味氨基酸的比例比較均衡，使得混合發酵產品風味柔和，口感飽滿。

圖2 混合發酵組不同呈味氨基酸比較Fig.2 Comparison of various DAA content in mixed fermentation group

疏水性氨基酸單獨水溶液存在時具有苦味，但在發酵產品中通常感受不到苦味。精氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的苦味閾值很低[13]，適當的苦味有利于產品風味的形成，但苦味過重則有損產品的質量。谷氨酸能抑制苦味，其鈉鹽呈鮮味。一些苦味氨基酸如苯丙氨酸和酪氨酸在低于它們的閥值濃度時，可以增強其他氨基酸的甜味和鮮味[14]。在醬油中，苯丙氨酸和酪氨酸也對風味形成起重要作用。Lopetcharat認為賴氨酸雖屬苦味氨基酸，卻能很好地豐富產品的滋味，鮮味主要是源于呈鮮的谷氨酸、呈甜的丙氨酸、呈甜的蘇氨酸和苦味的纈氨酸共同作用[15]?；旌习l酵的兔肉醬制品未有苦味，說明其他物質很好地緩解了苦味氨基酸的呈味效果，而且一定量的苦味氨基酸也可增強產品的鮮甜味效果。多種不同的呈味氨基酸以一定比例組合相互作用賦予了發酵兔肉醬制品獨特的滋味。

2.2 發酵處理對兔肉醬游離脂肪酸的影響

2.2.1 兔肉醬發酵前后游離脂肪酸的比較

表3 兔肉醬游離脂肪酸組成及相對含量Table 3 The composition and relative content of FFA in rabbit meat sauce

本試驗對接種復合發酵劑發酵的兔肉醬和未發酵的對照樣品進行游離脂肪酸的檢測和分析。由表3可知，共檢測到9種游離脂肪酸，其中，在發酵組樣品和未發酵組樣品中共有的是豆蔻酸(C14∶0)、棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、棕櫚油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)和亞麻酸(C18∶3)。在未發酵樣品中檢測到少量的花生二烯酸，而在發酵樣品中檢測到花生四烯酸?？傮w來看，在2組樣品中，相對百分含量較高的游離脂肪酸是棕櫚酸、油酸和亞油酸，說明這3種游離脂肪酸是兔肉中主要的游離脂肪酸。棕櫚酸屬于飽和脂肪酸(SFA)，油酸屬于單不飽和脂肪酸(MUFA)，亞油酸屬于多不飽和脂肪酸(PUFA)。經過發酵，游離脂肪酸的種類和相對含量出現了差別。

由表3可知，SFA中棕櫚酸(C16∶0)的相對含量最高，其次是硬脂酸和豆蔻酸。未發酵組棕櫚酸的相對含量高于發酵組，而豆蔻酸(C14∶0)和硬脂酸(C18∶0)的相對含量，發酵組高于未發酵組。有研究稱硬脂酸含量與風味之間有較高的負相關，而本試驗中檢測到硬脂酸含量較低，僅占約6%。

MUFA中油酸(C18∶1)的相對百分含量較高，在2組樣品中都達到20%以上。油酸存在于絕大多數的天然油脂中，能夠降低低密度脂蛋白(LDL)，但不會降低高密度脂蛋白(HDL)[16]。棕櫚油酸(C16∶1)在未發酵組相對含量較低，僅占3.19%，但在發酵組其相對含量顯著升高，達到6.10%。有研究發現棕櫚油酸含量與風味之間存在著較高的正相關[17,18]。表明在發酵過程中棕櫚油酸較油酸有更大程度的解離。不飽和脂肪酸大部分占據Sn-1 和 Sn-3 位，約有 30%的十八碳烯酸(油酸和亞油酸)占據 Sn-1 位，50%～60%的十八碳烯酸占據 Sn-3 位[19]。大量油酸被釋放出來，表明脂肪酶類對Sn-3位和磷脂具有較強的特異性，結果與Gambacorta和Hierro 的報道一致[20,21]。

PUFA中亞油酸(C18∶2)的相對含量最高，其次是亞麻酸(C18∶3)。在2組樣品中亞油酸占比都達到25%以上，且發酵組高于未發酵組，表明亞油酸在發酵過程中有更大程度的解離。亞麻酸屬于ω-3系列脂肪酸，ω-3 系列脂肪酸可降血脂，因而對防治心血管疾病有重要作用，同時，與兒童生長發育息息相關，還與智力發育和記憶等生理功能有一定關系。在未發酵組中還檢出微量的花生四烯酸，花生四烯酸是人體大腦和視神經發育的重要物質，對提高智力和增強視敏度具有重要作用，還具有預防心血管疾病、糖尿病和腫瘤的功效。發酵過程可以促進FFA的釋放，提高肉制品的消化率和吸收率，進而提升其營養價值。

2.2.2 兔肉醬不同類型游離脂肪酸的比較

表4 不同類型游離脂肪酸含量Table 4 Content of different types of FFA

由表4可知，2組樣品游離脂肪酸組成都表現為不飽和脂肪酸>飽和脂肪酸，而在不飽和脂肪酸中，多不飽和脂肪酸>單不飽和脂肪酸。從SFA的相對含量來看，未發酵組>混合發酵組，可能是發酵過程中微生物發酵劑的作用結果。從MUFA和PUFA的相對含量來看，均表現為混合發酵組>未發酵組。相對于未發酵組，發酵組中不飽和脂肪酸相對含量增加，飽和脂肪酸的相對含量減少，可能是由于在脂肪水解酶的催化反應中，具有較低熔點的不飽和脂肪酸比飽和脂肪酸具有更好的油-水介面，更易受脂肪水解酶的作用[22]。

脂肪酸的組成對肉品的風味會產生一定影響。SFA含量過多對產品風味會造成不良影響，但是它們可以通過微生物作用轉變成醛酮類或者經過β-氧化轉為短鏈游離脂肪酸和β-酮酸，β-酮酸還可以經過去羧基作用轉化成甲基-酮類，再經過還原反應生成仲醇，對風味產生積極影響。不飽和脂肪酸是肉類風味的重要前體物質，在發酵過程中會分解產生閾值較低的羰基化合物[23]。研究發現：PUFA與肉的風味及其總體可接受性呈負相關。PUFA含量過多易導致肌內脂肪氧化酸敗，從而產生酸味或哈喇味，影響肉品的感官和風味[24]；而MUFA與肉品風味及其整體可接受性呈正相關。SFA和MUFA含量高，有利于肉的嫩度、多汁性及風味。

不飽和脂肪酸有益于人體健康。肉類的營養價值可通過P∶S值(PUFA 與 SFA 的比值)來衡量。世界衛生組織(WHO)推薦，膳食中P∶S值高于0.4為佳[25]。本試驗中，發酵兔肉醬的P∶S值為0.96，高于未發酵兔肉的P∶S值0.92。依此來看，經過微生物發酵，不飽和脂肪酸含量以及脂肪酸的組成得到優化，使發酵兔肉醬具有更好的營養價值。

3 結論

利用氨基酸自動分析儀對不同處理的兔肉醬樣品進行游離氨基酸的分析。結果表明：添加發酵劑的兔肉醬中多種游離氨基酸及氨基酸的總量與對照組相比都有不同程度的增加，其中混合發酵劑的作用效果最為顯著，混合發酵組相對于對照組，游離氨基酸增加較明顯的8種分別是Leu，Ala，Lys，Phe，Asp，Met，Val，Thr。游離氨基酸總量較對照組增加了約50%，由0.1795 g/100 g增至0.2801 g/100 g，表明混合發酵劑在發酵過程中對蛋白質的水解起到了促進作用。

亮氨酸、丙氨酸、賴氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸是含量最高的6種氨基酸，在混合發酵兔肉醬總氨基酸中分別占到15.28%，12.64%，10.99%，9.06%，9.03%，7.85%，這6種氨基酸可認為是發酵兔肉醬的特征性呈味物質。分析發現：苦味氨基酸∶甜味氨基酸∶鮮味氨基酸∶甜味兼苦味氨基酸為3.30∶1.61∶1.02∶1，產品的感官風味良好，多種不同的呈味氨基酸以一定比例組合相互作用賦予了發酵兔肉醬制品獨特的滋味。

采用GC-MS方法共檢測到9種FFA，其中棕櫚酸(C16∶0)、油酸(C18∶1)和亞油酸(C18∶2)是占比最高的3種。2組樣品FFA的組成都表現為不飽和脂肪酸>飽和脂肪酸，而在不飽和脂肪酸中，多不飽和脂肪酸>單不飽和脂肪酸。相對于未發酵組，發酵組中不飽和脂肪酸相對含量增加，飽和脂肪酸的相對含量減少。發酵兔肉醬的P∶S值為0.96，高于未發酵兔肉醬的P∶S值0.92。經過微生物發酵，不飽和脂肪酸含量以及脂肪酸的組成得到優化，使發酵兔肉醬具有更好的營養價值。不利于肉類良好風味的硬脂酸(C18∶0)在樣品中相對含量較低，僅占約6%，而對風味形成有益的棕櫚油酸(C16∶1)在發酵組中相對含量較未發酵組顯著升高。

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EffectofFermentationTreatmentonNutritionandQualityofRabbitMeatSauce

WANG Dong

(Changzhou Technical Institute of Tourism & Commerce，Changzhou 213032,China)

Study the effects of different fermentation treatments on composition and content of free amino acids and fatty acids in rabbit meat sauce, which plays an important role in recognizing its nutritional value and flavor, it is also one of the nutritional standards for evaluating the fermented products. Meanwhile, it can provide theoretical basis for quality control and development of fermented rabbit meat sauce.

rabbit meat sauce；fermentation treatment；free fatty acids；free amino acids；nutrition；flavor

TS201.5

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.012

1000-9973(2017)11-0057-06

2017-05-15

王東(1983-)，男，講師，碩士，研究方向：旅游管理、烹飪教育教學管理、食品科學(烹飪方向)。