氮素對紫花苜蓿根莖葉氮含量及硝酸還原酶活性的影響

于鐵峰，劉曉靜，張曉玲，郝 鳳(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

氮素對紫花苜蓿根莖葉氮含量及硝酸還原酶活性的影響

于鐵峰，劉曉靜，張曉玲，郝 鳳
(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

采用營養液砂培方法進行室內盆栽試驗，以紫花苜蓿品種甘農3號(Medicagosativacv.Gannong No.3)和隴東苜蓿(Medicagosativacv.Longdong)為材料，比較研究了2種氮素形態(銨態氮、硝態氮)和5個氮素水平(0、105、210、315、420 mg/L)對現蕾期紫花苜蓿各部位氮含量及硝酸還原酶活性(NR)的影響。結果表明：2種氮素形態均能顯著提高紫花苜蓿根莖葉中硝態氮含量，銨態氮含量、全氮含量及硝酸還原酶活性，且隨著氮水平的提高呈先增大后減小的趨勢，在210 mg/L處理達峰值。從氮素形態分析，銨態氮肥有利于銨態氮含量的增加，且根莖葉中銨態氮含量、全氮含量在銨態氮210 mg/L處理達到最大值，且顯著高于其他處理；硝態氮肥有利于硝態氮含量的增加，且根莖葉中硝態氮含量、硝酸還原酶活性(NR)在硝態氮210 mg/L處理達到最大值，且顯著高于其他處理。各部位中，相同氮素形態下，根莖葉中銨態氮含量、硝態氮含量、全氮含量及NR活性均表現為葉片>根部>莖部，且甘農3號表現優于隴東苜蓿。基于經濟效益和生態效益考慮，銨態氮210 mg/L是培養紫花苜蓿較好的形態和水平。

銨態氮；硝態氮；紫花苜蓿；硝酸還原酶活性

氮素是作物生長必不可少的營養元素之一，既是作物最重要的結構性元素，又是作物生命代謝中必需的、最活躍的元素，同時也是作物高產、優質的重要保障。近年來，人們為追求作物的高產，氮素的施用量逐年增加，氮素利用率卻沒有隨之提高，在玉米[1]、水稻[2]、小麥[4]、大豆[5]、黃瓜[6]、菠菜[6]等作物上的研究均表明，過量的氮素供應并不利于產量的提高及品質的提升，這不僅增加成本導致經濟收益下滑，而且還會污染環境給生態效益增加負擔，因此，氮素的適宜施用是解決各種問題的根本途徑。植物根系吸收的氮素形態主要是硝態氮和銨態氮，其對植物的生長及生理特性影響不同，植物吸收、轉化、利用不同形態氮素的能力也不同[7-8]。如水田作物水稻偏愛銨態氮，而旱地作物甜菜、大豆等則喜好硝態氮。已研究報道銨態氮可明顯促進水稻的生長，表現在株高、地上部干重的顯著增加[9]。硝態氮則能明顯促進大豆生長及大豆幼苗及籽粒氮含量的提高，改善甜菜的營養品質，提高甜菜產糖量[10]。因此，研究氮素形態對植物的影響，對提高植物產量、改善品質有重要作用。硝酸還原酶(NR)是植物體內NO3--N同化步驟中的第1個酶，也是整個同化過程的限速酶，在植物氮代謝中起關鍵作用[11]。因此，NR是反映植物氮代謝能力的重要指標。

紫花苜蓿是主要的牧草飼料作物，是現代畜牧業生產中重要的植物性蛋白飼料資源，由于營養價值豐富，具有很高的經濟效益，被冠以“牧草之王”的美譽[12-13]。隨著現代畜牧業及奶制品產業的不斷發展，現代農業經濟結構的調整，其種植面積逐年增大[14]。紫花苜蓿作為豆科牧草雖可通過共生固氮固定大氣中的無機氮用于自身生長發育，但根瘤固定的氮素僅占其一生需氮量的50%～60%[15]，并不能滿足其生長所需，在土壤氮貧瘠的西北地區，尤其在干旱荒漠化地區[16]，補充外源氮是生產的必要保證[17]。在以高產優質為目的的生產中，要求外源氮既要滿足生產需要又不對共生固氮產生抑制。因此，了解紫花苜蓿對不同形態、不同水平氮素的吸收、轉化響應是提高氮肥利用率的有效途徑，同時為紫花苜蓿合理施肥，減少環境污染提供理論依據。

1 材料和方法

1.1試驗品種及菌株

供試品種甘農3號(Medicagosativacv.Gannong No.3)，簡寫為G3；隴東苜蓿(Medicagosativacv.Longdong)，簡寫為LD；均來源于甘肅農業大學草業學院。

供試菌株中華根瘤菌(12531)菌液，來源于甘肅農業大學草業學院。

1.2營養液配置

(1)Fahraeus無氮植物營養液：Na2HPO4·12H2O 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.12 g，EDTA-Fe 0.007 5 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，KH2PO40.1 g，Gibson 微量元素1 mL，H2O 1 000 mL，pH 6.5～7.0。

(2)Gibson微量元素液：H3BO32.86 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g，CuSO4·5H2O 0.08 g，MnSO4·H2O 1.54 g，Na2MoO4·H2O 1.17 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0[18]。

1.3試驗設計

試驗于2014年4月11日播種，采用營養液砂培法在甘肅農業大學室外防雨網室進行。選用長寬高為20 cm×12 cm×15 cm的花盆，花盆經75%酒精消毒后，裝入經自來水反復沖洗多次，在用蒸餾水清洗3次并高壓滅菌的粗砂。種子播種前進行滅菌處理，每盆均勻點播50粒滅菌種子，出苗7 d后間苗，每盆保證壯苗25株，然后澆入營養液。根據前期試驗結果[19]，試驗設計包括2個紫花苜蓿品種，2種氮素形態即：銨態氮、硝態氮 ，以不施氮處理為對照(CK)，2種氮素形態各設置5個氮素水平(0、105、210、315、420 mg/L)，共9個處理分別表示為，CK、硝態105、硝態210、硝態315、硝態420、銨態105、銨態210、銨態315、銨態420，每處理重復10次，共2×9×10=180 盆，完全隨機排列。以Fahraeus無氮植物營養液為基本營養液，分別加入Ca(NO3)2和(NH4)2SO4配制所需氮素濃度，并調節pH為7，結合無氮營養液一同施入。

紫花苜蓿出苗7 d后開始澆灌，每次澆灌營養液前用500 mL蒸餾水淋洗花盆2次，以沖走砂基質中積累的鹽分，而后澆入各處理營養液250 mL。苜蓿生長至3片復葉時，每盆均勻接種苜蓿根瘤菌液25 mL。現蕾期取樣測定各指標。

1.4測定指標及方法

硝態氮含量：參照文獻[20]水楊酸法測定；銨態氮含量參照文獻[21]茚三酮顯色法測定；全氮含量參照文獻[23]用濃H2SO4-H2O2法測定；硝酸還原酶(NR)參照文獻[23]方法測定。

1.5數據處理

采用Excel 2007軟件進行數據的整理，應用SPSS 19.0對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1氮素對苜蓿各器官硝態氮含量的影響

試驗各施肥處理硝態氮含量大于CK(P<0.05)，各處理不同器官硝態氮含量均不同，總體表現為葉片中硝態氮含量最大，根次之，莖中含量最小。2種氮素形態下，相同氮水平處理間硝態氮培養各器官的硝態氮含量高于銨態氮培養的，說明適當增加營養液中硝態氮的比例可增加植株體中硝態氮含量。同一品種中，不同氮形態，隨供氮水平的增高呈先增加后降低的趨勢，并且均在硝態氮210 mg/L達到峰值，除了在甘農3號根中，硝態氮210 mg/L與硝態氮315 mg/L表現為差異不顯著(P>0.05)外，其他各處理間均表現為硝態氮210 mg/L顯著高于其他各處理(P<0.05)。2個品種間，最優處理硝態氮210 mg/L下，甘農3號紫花苜蓿葉片中硝態氮含量達到1 043 μg/g，較對照提高了57%，較隴東苜蓿葉片硝態氮含量提高了33.9%，說明合理的硝態氮供應能明顯提高葉片硝態氮含量，不同品種間存在差異(圖1)。

2.2氮素對苜蓿各器官銨態氮含量的影響

各器官氮含量供氮處理均顯著高于CK(P<0.05)，各器官中，葉片銨態氮含量最高，表現為葉片>根部>莖部。2個品種均隨不同氮素水平的增加呈現先增大后降低的趨勢，2種氮素形態表現為銨態氮素添加更有利于苜蓿葉、莖、根中銨態氮含量的積累，且在銨態氮210 mg/L時，2個品種的銨態氮含量均達最大值，并顯著高于其他處理(P<0.05)。甘農3號苜蓿銨態氮210 mg/L處理下葉、莖、根銨態氮含量分別為486，388和424 μg/g，較CK分別增加98.4%，139.5%和122.0%；較隴東苜蓿銨態氮210 mg/L處理下分別增加了5.0%、9.9%、5.0%(圖2)。說明銨態氮較硝態氮更利于苜蓿銨態氮含量的積累，合理的銨態氮供應能提高苜蓿葉、莖、根中銨態氮含量，不同品種間存在差異。

圖1 氮素形態及水平處理下苜蓿各器官硝態氮含量Fig.1 Effects of nitrogen forms and levels on NO3--N content in various organs of alfalfa

圖2 氮素形態及水平處理下苜蓿各器官的銨態氮含量Fig.2 Effects of nitrogen forms and levels on NH4+-N content in various organs of alfalfa

2.3氮素對苜蓿各器官全氮含量的影響

各施氮處理均顯著高于CK(P<0.05)，說明氮素添加可以顯著提高苜蓿全氮含量。2個品種的根、莖、葉中氮素含量不同，均表現為葉片中氮素含量最高，總體表現為葉片>根部>莖部。同水平氮素添加比較，甘農3號苜蓿全氮積累量好于隴東苜蓿，2種氮形態，相同氮水平相比較，除了甘農3號葉、根硝態氮315略高于銨態氮315外，其他處理均表現為銨態氮同水平高于硝態氮同水平。供試品種各硝態氮與銨態氮處理隨著氮水平的增加均呈拋物線變化。全氮最高峰值均出現在氮水平為210 mg/L處，并且銨態氮210 mg/L明顯好于硝態氮210 mg/L處理，且顯著好于其他各處理(P<0.05)。甘農3號苜蓿銨態氮210 mg/L處理， 其葉、莖、根全氮含量分別為4.34%，2.24%和3.83%，較CK分別增加48.1%，64.7%和77.3%。較隴東苜蓿銨態氮210 mg/L處理下葉、莖、根增加了3.6%，11.4%和15.0%。說明銨態氮210 mg/L處理最利于苜蓿全氮積累(圖3)。

圖3 氮素形態及水平處理下2個紫花苜蓿品種不同部位的全氮含量Fig.3 Effects of nitrogen forms and levels on total nitrogen content in various organs of alfalfa

2.4氮素形態及水平對苜蓿各器官NR活性的影響

各處理NR活性在供氮處理下均顯著高于CK(P<0.05)，葉片的NR活性高于根、莖器官，其活性順序表現為：葉>根>莖(圖4)。說明供氮能促使苜蓿各器官NR活性提升，且葉片硝酸還原反應最強，是最主要的氮同化器官。2品種紫花苜蓿各部位NR活性均隨供氮水平的增高呈先增加后降低的趨勢，甘農3號紫花苜蓿NR活性強于隴東苜蓿。2種氮素形態下，NR活性峰值均在210 mg/L出現。2氮素形態相比，硝態氮210 mg/L培養高于銨態氮210 mg/L，且顯著高于其他處理(P<0.05)。最優硝態氮210 mg/L下，甘農3號苜蓿葉、莖、根中NR活性分別為37.4，31.2和36.5 μg/(g·h)，較隴東苜蓿分別增加7.5，11.4和7.7 μg/(g·h)。說明硝態氮對NR活性影響明顯大于銨態氮，NR活性除受2種氮素形態的影響不同外，品種間也存在差異。

圖4 氮素形態及水平處理下苜蓿各器官的硝酸還原酶活性Fig.4 Effects of nitrogen forms and levels on nitrate reductase activity in various organs of alfalfa

3 討論

氮素是苜蓿生長發育過程中必須營養元素之一，銨態氮與硝態氮是作物吸收利用的主要的氮素形式，不同形態氮素在各器官的含量可反映作物氮素營養狀況和生理功能的強弱，并不同程度的影響作物品質形成[24]。黃展飛等[25]研究表明，施肥對生長期梨葉片銨態氮變化的影響大于硝態氮。研究表明，紫花苜蓿各器官硝態氮含量、銨態氮含量在210 mg/L下達到峰值，且銨態氮肥利于銨態氮含量的增加，硝態氮肥利于硝態氮含量的增加。從各器官氮含量分析，均表現為葉片>根部>莖部。說明在營養生長階段，紫花苜蓿的葉片是氮累積的中心，根次之。分析原因多是由于各器官對氮素的吸收、轉運和利用不同，進而造成氮積累的差異。張英鵬等[26]利用水培法研究了不同供氮水平對菠菜硝酸鹽及各器官含量的影響，試驗結果為葉片氮含量>葉柄氮含量，氮素4～8 mmol/L，葉片硝酸鹽含量呈降低趨勢，與試驗研究基本一致。

紫花苜蓿作為一種重要的植物蛋白飼料，其全氮含量能直接反應自身的營養價值，甚至經濟價值，施肥是提升苜蓿營養價值的一項重要技術[27-28]。研究表明，2種形態的氮素添加均能增加現蕾期苜蓿根、莖、葉等器官的氮含量，且在210 mg/L下達最大值。胡華鋒等[29]對黃河灘區紫花苜蓿的研究也表明，適當的氮素添加可顯著提高苜蓿氮含量，尤其是葉、莖器官的氮含量，且隨施氮量增加，苜蓿地上部氮含量呈先增加后降低的趨勢。在試驗中各器官呈現葉片>根部>莖部的規律；相同的氮水平下，銨態氮培養要優于硝態氮培養。李燦東等[30]對大豆的研究結果與此次試驗結果基本一致。葉片和莖作為家畜采食的主要部位，其氮含量越高，營養價值越高。此次研究中在銨態氮210 mg/L處理下莖中的全氮含量最高，而葉和根中則在銨態氮315 mg/L處理最好，但過多的氮素添加會給經濟效益和生態效益帶來負擔，因此，基于這兩方面考慮，銨態氮210 mg/L是培養紫花苜蓿較好的形態和水平。

硝酸還原酶是植物氮代謝的關鍵酶[31]，其活性對調節植物體內硝態氮同化水平和蛋白質合成具有重要意義[32-33]。氮素水平是影響NR活性的主要原因之一，杜永成等[34]研究了4個硝態氮添加水平(N0、60、120、180 kg/hm2)對甜菜NR活性的影響，結果表明硝態氮120 kg/hm2可顯著提高甜菜NR活性。張智猛等[2]研究表明，施氮水平明顯影響花生的蛋白含量及NR活性，適量施氮(45～90 kg/hm2)可使花生各營養器官中NR活性提高，尤其氮素水平對花生葉片NR影響較大，對莖和根中活性大小的影響則較小。研究表明，不同氮水平下現蕾期苜蓿各器官NR活性均表現為葉>根>莖，在硝態氮210 mg/L處理下，NR活性達到峰值，并顯著高于其他處理(P<0.05)。NR活性與氮素形態關系也很密切，試驗表明，紫花苜蓿現蕾期，硝態氮對NR活性影響明顯大于銨態氮。陳煜等[35]對大豆利用硝態氮、銨態氮及混合態氮對4個大豆品種進行氮素誘導處理，結果表明硝態氮對提高4個品種NR活性效果最好，銨態氮的效果較差，與本文研究結果一致。究其原因可能與NO3-是NR的底物和誘導劑有關，而NH4+的誘導效果不如NO3-，可能是NH4+作為NO3-兩步還原反應的終產物所產生的反饋抑制作用所致[36-37]。

4 結論

2種氮素形態顯著提高紫花苜蓿根莖葉中硝態氮，銨態氮、全氮含量及硝酸還原酶活性(P<0.05)，而且，隨氮水平的提高呈單峰曲線的變化趨勢，在210 mg/L處理達峰值。從氮素形態分析，銨態氮肥有利于銨態氮含量的增加，且在210 mg/L處理下，根，莖和葉中銨態氮、全氮含量達最大值，顯著高于其他處理(P<0.05)；硝態氮肥有利于硝態氮含量的增加，且在210 mg/L處理下，根莖葉中硝態氮含量、硝酸還原酶活性(NR)達到最大值，顯著高于其他處理(P<0.05)。從各部位分析，相同氮素形態下，根莖葉中銨態氮含量、硝態氮含量、全氮含量及NR活性均表現為葉片>根部>莖部，且甘農3號表現優于隴東苜蓿。基于經濟效益和生態效益考慮，銨態氮210 mg/L是培養紫花苜蓿較好的形態和水平。

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Effectsofnitrogenonnitrogencontentandnitratereductaseactivityinrootstemandleafofalfalfa

YU Tie-feng,LIU Xiao-jing,ZHANG Xiao-ling,HAO Feng

(CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofPrataculturalEcosystem,MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-USCenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

The nitrogen content and nitrate reductase activity (NR) in alfalfa organs were studied based on 2 nitrogen forms (nitrate nitrogen and ammonium nitrogen) and 5 nitrogen levels (0,105,210,315,420 mg/L).Two cultivars,Medicagosativacv.Gannong No.3 andMedicagosativacv.Longdong,were selected as materials at squaring stage,and the experiment was conducted outdoors(in flashing net room) using sand culture method.The results showed that the content of NO3--N,the content of NH4+-N and total nitrogen content in root and stem and leaf of alfalfa under two nitrogen treatments were significantly higher (P<0.05),and showed a trend of increased first and then decreased with the increase of nitrogen level,peaked at 210 mg/L.The content of NO3--N,the content of NH4+-N and total nitrogen content in root,stem and leaf of alfalfa under 2 nitrogen treatments were significantly higher (P<0.05),and showed a trend of increased first and then decreased with the increase of nitrogen level,peaked at 210 mg/L.NH4+-N was beneficial to content of NH4+-N,The content of NH4+-N and total nitrogen content reached peak and significantly higher than other treatments (P<0.05) at the NH4+-210;The content of NO3--N and the nitrate reductase activity reached peak and significantly higher than other treatments (P<0.05) at the NO3--210;Analysis of organ,the maximum of the contents of ammonium nitrogen,nitrate nitrogen,total nitrogen and NR were found at leaves,minimum in stem under the same nitrogen form,and Gannong No.3 was better than that of Longdong.Based on the economic benefit and ecological benefit,the NH4+-210 was better.

NH4+-N；NO3--N；alfalfa；nitrate reductase activity

S 541.9

A

1009-5500(2017)05-0014-07

2017-03-08；

2017-03-21

公益性行業(農業)科研專項(201403048-8)；國家自然科學基金項目(31460622)；甘肅省科技支撐項目(1504NKCA003)資助

于鐵峰(1983-)，男，黑龍江省寶清縣人，在讀博士研究生。

E-mail：yutiefeng520@163.com

劉曉靜為通訊作者。