豬RTL1基因多態性及其與胴體、肉質性狀的關聯分析

喬木　程碧軍　武華玉

摘要：旨在研究反轉錄轉座子1基因（retrotransposon-like-1，RTL1）潛在的變異與豬胴體和肉質性狀的相關性。測序發現在豬RTL1基因編碼區1 209 bp處存在G/A突變，利用PCR-Fnu4H I-RFLP方法在9個豬種中進行了基因分型，并且在360頭大白豬×梅山豬F2代群體中進行性狀關聯分析。結果表明，該位點與皮率、內脂率、6-7腰椎間膘厚、胸腰椎間膘厚、背最長肌pH、股二頭肌肌肉色值呈顯著相關（P<0.05），與骨率、肩部膘厚、臀部膘厚、平均背膘厚、背最長肌失水率、背最長肌系水力、背最長肌肌肉色值呈極顯著相關（P<0.01）。

關鍵詞：豬；RTL1基因；單核苷酸多態性；性狀關聯分析

中圖分類號：S828.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）20-3948-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.20.038

Abstract： This study was conducted to investigate the potential association of variation in the retrotransposon-like-1 （RTL1） gene with carcass and meat quality traits in pigs. Cloning and sequencing found that there was a G/A mutation at 1 209 bp in the porcine RLT1 gene coding region. Using PCR-RFLP， SNP of RTL1 gene was detected in nine different pig breeds and performed associations with carcass and meat quality traits in 360 Large White and Meishan F2 hybrids. The results showed this polymorphism is significant association with skin percentage，internal fat rate，6-7 rib fat thickness，thorax-waist fat thickness，Meat pH（m.longissimus Dorsi，LD） and meat color value（BF）（P<0.05），is higher significant association with bone percentage，shoulder fat thickness，buttock fat thickness，average backfat thickness，longissimus dorsi drip loss rate，longissimus dorsi water holding capacity and meat color value （LD）（P<0.01）.

Key words： pig； RTL1 gene； single nucleotide polymorphism （SNP）； association analysis

反轉錄轉座子1基因（Retrotransposon-like-1，RTL1），又名父本表達基因11（paternally expressed gene 11，Peg11）， 在人和小鼠中為父本表達的印記基因，不含內含子序列[1，2]。RTL1基因在胚胎和胎盤組織中表達量很高，對母體胎盤與胎兒的營養傳遞起著重要作用，敲除該基因的小鼠表現為胎兒死亡率升高、新生兒生長停滯、胎盤尺寸偏小[3]； 與人的胎兒發育和新生兒的生長也有密切關系[4，5]。該基因位于DLK1-DIO3印記區域，該區域基因對肌肉發育和脂肪沉積有一定的影響[6，7]，在轉基因小鼠中異位表達RTL1基因，會導致肌肉肥大[8]；此外，該基因與callipyge綿羊的肌肉肥大相關，雙肌臀的綿羊中RTL1基因的表達量是正常綿羊中的12倍[9，10]。RTL1基因與動物的生長和肉質性狀有著密切的關系。目前關于此基因在豬中的研究較少，本研究分離克隆了RTL1基因，對其遺傳多態性進行了篩選，并與豬胴體和肉質性狀進行關聯分析，以期獲得豬生產性狀相關的新分子標記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集大白豬和梅山豬（華中農業大學試驗豬場）各4頭血樣，提取基因組DNA，用于基因克隆及多態性檢測；

大白豬×梅山豬F2代群體360頭（華中農業大學實驗豬場），收集性狀記錄，用于關聯分析；采集9個品種豬的DNA樣品包括：大白豬、長白豬、梅山豬、皮特蘭豬、杜洛克豬、陽新豬、皖南豬、鄂西黑豬和監利豬，用于基因型頻率分析。

1.2 PCR擴增、測序及SNP篩選

基因組DNA的提取采用QIAGEN公司的DNA提取試劑盒（QlAamp DNA Mini Kit50），按照說明書進行提取。

根據豬RTL1基因的基因組序列（GenBank登錄號：ACF47571），采用Primer 5軟件設計引物。上游引物：5′-AGGGCCACCCCAGCCTCGA-3′，下游引物：5′-GGCTTCTCGAAGAGCTGGAC-3′，由北京奧科生物技術有限公司合成。PCR反應體積為20 μL：DNA 模板1 μL、2×Taq PCR Mix 10 μL、ddH2O 8 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL。PCR 反應程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，66.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR 產物于1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，以3 μL DNA Marker DL 2000作為參照。電泳結束后，用凝膠成像系統觀察擴增結果。將目的條帶用百泰克試劑盒回收純化，回收后的PCR產物與pMD-18T 載體連接并轉化DH5α感受態細胞， 克隆子送至北京奧科生物技術有限公司測序，序列比對篩選SNP。endprint

1.3 SNP驗證

采用PCR-Fnu4H Ⅰ-RFLP方法對SNP位點進行檢測。酶切體系為10 μL，其中PCR擴增產物5 μL，10×Buffer 1 μL，限制性內切酶0.5 μL（10 U/μL），ddH2O 3.5 μL，37 ℃酶切反應4 h，后經2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 統計分析

采用SAS 8.0軟件的GLM程序進行標記的關聯分析，采用REG程序計算基因的加性效應和顯性效應，所用模型[11]為Yijkl=μ+Gi+Fj+Sk+Yl（+bijklXijkl）+eijkl。Yijkl為性狀表型值，μ為群體均值，Gi為基因型效應，Sk為性別效應，Yl是年份效應，Fj和Yl分別為家系和年度效應，bijk為屠宰體重的回歸系數，Xijk是協變量屠宰體重，eijk為殘差效應。

2 結果與分析

2.1 豬RTL1基因多態性檢測結果

豬RTL1基因外顯子1 209 bp處的G/A突變能夠引起外切酶Fnu4H Ⅰ酶切位點的改變，當該位點為G時，可以被內切酶Fnu4H Ⅰ切為兩個片段126 bp和40 bp（GG型），當該位點為A時不能被酶切，片段大小為166 bp（AA型），當G和A都存在時，有3條帶，即126、40和166 bp（AG型）， 酶切分型結果見圖1。

2.2 豬RTL1基因SNP位點在不同豬種中的分布規律

在9個中外豬種中進行多態性分布檢測，其中5個國內豬種（梅山豬、陽新豬、皖南豬、監利豬和鄂西黑豬）和4個外來品種（大白豬、長白豬、杜洛克豬和皮特蘭豬），結果如表1所示。G等位基因頻率在國外豬中占優勢，在國內豬種中A等位基因占優勢。

2.3 關聯分析

在360頭大白豬×梅山豬F2代群體中分析了豬RTL1基因SNP位點基因型與胴體性狀和肉質性狀的相關性。如表2和表3所示，與皮率、內脂率、6-7腰椎間膘厚、胸腰椎間膘厚、背最長肌pH、股二頭肌肌肉色值呈顯著相關（P<0.05），與骨率、肩部膘厚、臀部膘厚、平均背膘厚、背最長肌失水率、背最長肌系水力、背最長肌肌肉色值呈極顯著相關（P<0.01）。

3 討論

本研究通過PCR-Fnu4H Ⅰ-RFLP方法在360頭大白豬×梅山豬F2 代群體中檢測了RTL1基因外顯子1 209 bp處G/A突變位點，關聯分析結果顯示RTL1基因與胴體性狀和肉質性狀呈顯著相關。AA基因型個體的內脂率、肩部膘厚、6-7腰椎間膘厚、胸腰椎間膘厚、臀部膘厚、平均背膘厚顯著高于GG基因型，這與不同品種中基因型分布規律相吻合，國內豬種中A等位基因占優勢，而國內豬種比國外豬種具有較高的肥肉率，說明A等位基因有促進脂肪沉積的效應。在肉質性狀方面，AA基因型個體與比GG基因型個體相比，具有較高的背最長肌肌肉色值和股二頭肌肌肉色值，較低的背最長肌pH和背最長肌系水力，說明該位點可以作為改善豬肉質性狀的分子標記。

在基因效應方面，皮率、板油重、內脂率、6-7腰椎間膘厚、胸腰椎間膘厚、背最長肌pH等性狀加性效應顯著（P<0.05），骨率、肩部膘厚、臀部膘厚等性狀加行效應極顯著（P<0.01）。加性效應是可以遺傳的，因此可以采用分子標記輔助選擇和常規選擇項結合的方法對豬皮率、板油重、內脂率等性狀進行固定[12]。RTL1基因可以作為改善豬脂肪沉積和肉質性狀的候選基因。

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