CRISPR/Cas9系統及其在單子葉植物中的應用

徐繼法+徐艷+趙吉強+陳磊+郭善利+宋建成

摘要：CRISPR/Cas9系統作為第3代人工核酸內切酶，已經成為繼鋅指核酸內切酶（zinc finger endonuclease，簡稱ZFNs）和類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，簡稱TALENs）之后的新型高效定點的基因組編輯新技術。作為新型的基因編輯技術，CRISPR/Cas9系統擁有突變效率高、構建簡單、花費成本低等特點，自其出現之后，受到廣泛關注且得到迅速發展，給植物基因組研究和遺傳育種帶來革命性的變革。目前，該技術已經在多種單子葉植物中實現了基因組定點精確編輯，包括水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）等單子葉植物。

關鍵詞：CRISPR/Cas9系統；基因編輯技術；單子葉植物；植物基因組；遺傳育種

中圖分類號： Q789 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0021-04

收稿日期：2016-04-24

基金項目：國家自然科學基金（編號：3137616）；山東省自然科學基金（編號：ZR2011CM044、ZR2011CM006）。

作者簡介：徐繼法（1987—），男，山東棗莊人，碩士，研究方向為植物分子發育生物學。E-mail：dongfengxjf@163.com。

通信作者：宋建成，博士，碩士生導師，研究方向為植物分子發育生物學。E-mail：jcsong88@yahoo.com。 基因組編輯技術是指將目的基因整合到宿主基因的特定靶位點上，從而達到特異性的改造生物基因組DNA，是基因功能研究的重要方法?；蚪M編輯技術通過構建人工核酸內切酶將基因組靶位點雙鏈DNA片段特異性切割開斷裂（double strand broken，簡稱DSB），繼而使細胞內非同源末端連接（non-homologous end joining，簡稱NHEJ）和同源重組（homologous recombination，簡稱HR）這2種修復機制激活，斷裂DNA片段得到修復，使該位點出現插入和缺失以及同源片段重組，此過程不僅可以使基因發生突變也可實現同源重組，可以說真正實現了對基因的編輯。目前，能對基因實現定點精確編輯的技術主要有鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，簡稱ZFNs）[1-2]、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（transcription activator like effector nucleases，簡稱TALENs）[3-4]、成簇的規律的間隔的短的回文重復序列和相關蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR- associated protein，簡稱CRISPR/Cas9）[5-6]。

CRISPR/Cas9系統在應用方面與ZFNs、TALENs相比具有巨大的優勢，載體構建操作簡單，對每1個基因靶位點修飾只需合成1個靶標sgRNA，就能順利實現對基因組精確定點編輯，而ZFNs、TALENs的編輯操作則相對繁瑣復雜[7-8]；此外，CRISPR/Cas9系統還擁有試驗周期短、成本花費低、易于推廣等特點。2013年，CRISPR/Cas9系統作為一種新的突破性基因編輯技術出現，就得到迅速推廣與應用。目前該系統在水稻、小麥、玉米、高粱等單子葉植物基因組中成功實現了精確定點編輯。

1 CRISPR/Cas9系統的基本結構

CRISPR/Cas9系統是細菌和古生菌在長期自然進化過程中針對噬菌體、病毒和外源DNA入侵進化形成的一種適應性免疫防御系統，其結構也是長期自然選擇的進化結果。約40%的細菌和90%的古細菌都含有CRISPR/Cas9系統[9-10]。CRISPR/Cas9系統由CRISPR序列元件及其位點附近的一系列保守的相關Cas蛋白基因（CRISPR-associated genes，簡稱Cas genes）組成。CRISPR/Cas9的基因座結構相對簡單（圖1），主要由5′端的tracrRNA、Cas蛋白編碼基因、CRISPR位點組成。不同物種間CRISPR位點數目與重復序列的數目也有所不同[11-13]，但均包括3種序列（重復-間隔序列、Cas蛋白序列、前導序列）。重復-間隔序列由多個相同的重復序列及穿插其間的間隔序列組成，間隔序列可以特異性地識別外源DNA。

1.1 CRISPR/Cas9系統的3個主要類型

CRISPR/Cas9系統可分為3種不同的類型：TypeⅠ、TypeⅡ、Type Ⅲ[14-15]。TypeⅠ系統是最復雜以及含有Cas蛋白最多的系統，主要分布于細菌和古細菌中，包含6個蛋白，核心蛋白元件為Cas3蛋白，具有核酸酶和解旋酶的功能。在防御外源DNA入侵時，多個Cas蛋白與成熟的crRNA共同結合形成CRISPR相關病毒防御復合物CASCAD（CRISPR associated complex for antivirus defense，簡稱CASCAD），在crRNA的介導下，CASCAD與入侵的外源DNA結合，促使CASCAD內的crRNA與外源DNA的互補鏈配對形成R環結構，Cas3的核酸酶識別R環結構后先將互補鏈切開，隨后在Cas3的解旋酶和核酸酶作用下再將非互補鏈酶切，使其降解。

Type Ⅱ系統主要分布于細菌中，結構組分簡單，核心蛋白元件為Cas9蛋白，Cas9蛋白包含2個功能結構域，1個在N端，有類似于Ruc核酸酶的活性；另1個在中部，有類似HNH核酸酶的活性[16]。Ⅱ型與其他2種類型有著截然不同的區別，成熟的crRNA是在Cas9蛋白獨立參與下進行的，并與之結合形成復合物，即可對入侵的噬菌體DNA或是外源質粒進行酶切、降解。目前Ⅱ型在CRISPR/Cas9系統研究中最為深入，而且是被改造的最成功的人工核酸酶[17-19]。endprint

Type Ⅲ系統主要分布于古細菌中，只有少數的細菌擁有該類型。該系統的核心蛋白元件為Cas10，具有RNA酶活性和類似于TypeⅠ的CASCAD功能，主要參與crRNA的成熟以及外源核酸的降解。根據系統的靶標對象不同可將Ⅲ分成2種亞型：TypeⅢA、TypeⅢB，前者的靶標對象為mRNA，后者為DNA，這也反映了自然界中的CRISPR/Cas9系統的多態性。

1.2 CRISPR/Cas9系統的作用原理

CRISPR/Cas9系統通過使用CRISPR RNA（crRNA）來指導入侵核酸的沉默，為細菌和古細菌提供針對病毒和外源質粒的適應性免疫。該適應性免疫系統依賴于由crRNA所引導的特異性序列和Cas9蛋白的內切核酸酶活性來清除入侵的病毒和質粒DNA，其主要作用過程可通過以下3步進行[20]：（1）間隔序列的獲得。當外來的病毒或外源質粒入侵細菌時，CRISPR/Cas9系統能鑒別入侵核酸中的幾個保守的緊鄰靶區域下游的原始相鄰堿基序列（protospacer adjacent motif，簡稱PAM），然后將臨近PAM的間隔序列（PAM，序列：NRG，其中R=G/A）修飾加工并整合到自身CRISPR基因座中。（2）CRISPR基因座的表達。CRISPR基因座先被轉錄成pre-crRNA，然后與tracrRNA形成一個雙鏈復合物，Cas9幫助RNase Ⅲ將復合物切割成小片段，即生成成熟的crRNA。（3）CRISPR系統特異性降解入侵的外源核酸。成熟的crRNA與tracrRNA結合形成發夾RNA，發夾RNA再與Cas9結合形成功能性復合物（Cas9/crRNA/tracRNA），然后在成熟的crRNA中的靶向核苷酸序列引導下將Cas9核酸內切酶結合至入侵的DNA的PAM處互補靶位點上，Cas9切割入侵的外源DNA靶序列，入侵的外源核酸被降解。

2012年，Jinek等針對雙鏈tracrRNA與crRNA基因的功能，設計出能模擬二者結合后形成發夾結構的單鏈引導RNA（single guide RNA，簡稱sgRNA），sgRNA具備了crRNA-tracrRNA復合物的功能，在sgRNA-Cas9系統中sgRNA部分能與Cas9核酸內切酶結合并將后者引導至基因組上的靶位點處進行結合與切割[21]。與目前廣泛使用的基于ZFNs以及TALENs的基因定點修飾技術相比，CRISPR/Cas9系統的識別機制賦予了該打靶系統在合成組裝上無可比擬的優越性，因其可以通過簡單的替換一段短的RNA分子來改變其序列識別的特異性，故而更為簡便、經濟。

2 CRISPR/Cas9系統的構建及在單子葉植物中的研究進展

2.1 植物Cas9蛋白的優化選擇

由于CRISPR/Cas9系統是細菌細胞所特有的，因此運用這一系統實現對動植物細胞的編輯，必須借助細菌的CRISPR/Cas9系統，CRISPR/Cas9系統類型Ⅱ結構簡單、便于操作，對靶序列的切割只需tracrRNA、Pre-crRNA、Cas9、RNase Ⅲ等4種成分。Cas9基因來源于化膿性鏈球菌Ⅱ型CRISPR獲得性免疫系統，編碼區全長為4 107 bp[21]。Cas9基因應用于真核生物基因組編輯還需要添加核定位信號，以保證Cas9蛋白能定位到細胞核[17]。Cas9基因在植物基因組定點編輯時，目前主要采取植物密碼子優化[17，22]，部分直接使用動物密碼子優化[23-24]。Feng等研究對水稻SPP、YSA、ROC5基因進行了準確地定點編輯，通過對Cas9的密碼子進行偏好性優化，在Cas9碳端添加核定位信號，并用35S啟動子驅動Cas9表達，最后成功對基因進行了定點編輯[25]。因此對植物基因組的編輯過程中都采用了該類型。

2.2 植物的CRISPR/Cas9編輯載體系統的構建

目前大部分植物CRISPR/Cas9載體系統采用常規的酶切連接克隆方法構建Cas9/sgRNA表達載體，只適合同時打靶單個或少數幾個靶點。Ma等構建了一套適用于單子葉植物、雙子葉植物并可進行多靶點修飾的pYLCRISPR/Cas9載體系統[26]。該載體系統利用PCR擴增獲得多個含不同靶序列的sgRNA表達盒，并通過基于Ⅱs型限制性內切酶（如BsaⅠ）的Golden Gate ligation[27]或者基于復合酶的Gibson Assembly[28]克隆技術，一次性整合到CRISPR/Cas9雙元載體上。此外，Orel等也設計了Gateway雙元T-DNA載體來共表達Cas9和sgRNA，并利用報告基因DGU.US來研究CRISPR/Cas9系統能否使雙鏈DNA發生斷裂[29]。研究結果表明，當二者被共轉化到水稻的愈傷組織時，只有含有報告基因的CRISPR/Cas9系統所轉入的愈傷組織上含有GUS著色點，對照只有報告基因無GUS著色點，說明CRISPR/Cas9系統在轉入植物細胞中依然有活性進行表達。其他的CRISPR/Cas9載體系統使用傳統的Ⅱ型限制性內切酶克隆方法，需要多輪克隆將少數幾個sgRNA表達盒組裝到CRISPR/Cas9雙元載體。

由于CRISPR/Cas9系統能使植物細胞中產生雙鏈DNA斷裂，并且其基因編碼區產生的大部分突變會產生移碼或片段缺失，可導致靶標基因的功能缺失，使植物遺傳性狀發生變異。由此可見，CRISPR/Cas9系統的構建能迅速提高其應用與推廣。

2.3 CRISPR/Cas9系統在單子葉植物中性狀改良與基因功能的研究

目前由CRISPR/Cas9系統所介導的植物基因組定點編輯技術的應用主要有植物功能基因組學研究、農作物品種的優良選育、有針對性地利用CRISPR/Cas9系統來改造農作物品種，提高植物的抗病性、提高產量等[30]。目前該CRISPR/Cas9技術已經被迅速推廣及利用，并已經有多位研究者對該系統在水稻、小麥、玉米和高粱等多種植物中的應用情況進行了綜述，闡述該技術在這些植物的基因組編輯中的應用以及可行性。endprint

Jiang等利用CRISPR/Cas9系統設計靶向水稻細菌性疫病的易感基因的OsSWEET14和OsSWEET11的啟動子區域，并在水稻原生質體中實施轉化，測序結果顯示靶標位點發生了定點突變[31]。Xie等同樣利用該技術也構建水稻3個不同位點的sgRNAs，檢測的突變效率為3%～8%；此外，研究者還發現構建CRISPR/Cas9系統在不完全匹配的基因組位點存在脫靶效應，進一步分析表明sgRNA與靶標DNA的錯配位置是決定Cas9/gRNA打靶特異性的關鍵因素[23]。為了最大限度地降低可能存在的脫靶效應的影響，應該謹慎選擇spacer序列，盡可能選擇序列特異性較高的位置。此外，結合植物研究的特點，針對同一個目標基因，分別使用不同的spacer構建獨立的基因敲除個體，進而綜合分析試驗結果是排除偶然因素干擾試驗結果的行之有效的方法。

Wang等利用CRISPR/Cas9系統實現了對小麥MLO基因的定向突變，即針對MLO基因的單個拷貝設計CRISPR/Cas9靶位點，在原生質體和轉基因植物中的結果表明，突變只發生在A基因組上[32]。結果表明，在多倍體的小麥中，利用基因組編輯技術既可以同時突變多個拷貝，也可以特異地突變單個基因拷貝。此外，該研究還利用基因組編輯系統引發的DNA自身修復途徑非同源末端連接（non-homologous end joining，簡稱NHEJ）在小麥MLO位點實現了基因的定點插入，插入的片段可以穩定遺傳。Sharma等利用面包小麥（Triticum aestivum）EST數據庫中的120萬條序列，采用嚴謹型參數裝配出27 268條contigs。在2 832條contigs中鑒定出3 327條EST-SSR和每個contig中可能的CRISPR結合位點，并指出利用CRISPR系統可能減少小麥植酸含量的重要靶標基因[33]。

Liang等利用TALENs、CRISPR/Cas9等2種技術對玉米相關基因中分別進行了定點編輯，二者都在玉米原生質體獲得了很高的突變效率。此外還發現，這2種系統誘導玉米原生質體靶基因突變的效率基本相似[34]。Xing等同樣也利用CRISPR/Cas9系統實現了在原生質體中對玉米的高親和性鉀轉運蛋白基因（ZmHKT1）的定點編輯，同時也使CRISPR/Cas9系統在轉基因玉米植株中進行了穩定遺傳[35]。

試驗結果表明，CRISPR/Cas9系統可以對單子葉植物的單一外源基因、內源基因或是單子葉植物的多個基因進行定向的基因編輯。然而，在應用過程中Cas9蛋白的修飾、啟動子的選擇等要素對單子葉植物基因組編輯的效率影響完全不同，這在設計CRISPR/Cas9系統的實際操作過程中須要注意。以CRISPR/Cas9基因組編輯技術正廣泛應用于植物新基因的功能研究，比反義基因和RNA干擾（RNAi）技術的效果更好。因此，CRISPR/Cas9基因組編輯技術將更廣泛應用于植物基礎生物學研究和作物遺傳改良中。

3 展望

CRISPR/Cas9技術自2013年初開始被成功應用以來，已被迅速應用于多種生物的研究，其在基因編輯中的優越性是顯而易見的，相較于傳統的轉基因技術而言是高效的、精準的，相對于TALENs和ZFNs技術而言，其操作更加簡便、敲除效率更高、基因編輯更加精準，大大降低了脫靶機率。最近美國麻省理工學院和哈佛學院的張峰博士實驗室又鑒定出2種與Cas9蛋白具有相似功能，同樣來源于CRISPR系統的Cpf1蛋白，形成了CRISPR/Cpf1系統[36]。Cpf1的PAM特異性以及切割方式都不同于Cas9，這一發現無疑是對基于CRISPR的基因組編輯技術的重要補充。

CRISPR/Cas9及其相關技術系統的發展隨著植物功能基因組研究的開展，以及對CRISPR/Cas9系統的深入研究，將全面推動基因組編輯技術的發展，其應用領域必然會越來越廣。毫無疑問，CRISPR/Cas9系統將是一種強大而高效的輔助工具，它的出現為植物基因工程的研究提供了一個新的想法和思路，必將給植物基因組定點編輯和植物遺傳育種帶來革命性的變革。

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