雌黃連木遺傳多樣性

管菊+李琬婷+黃曉霞+程小毛

摘要：利用10對擴增片段長度多態性（AFLP）引物對來自河南長葛、安陽2個地區5個不同種群的139份雌黃連木樣品進行遺傳多樣性研究。結果顯示，在種水平上，香農（Shannon）信息指數（Ⅰ）為0.492 7，Neis基因多樣性指數（He）為0.335 3，表明雌黃連木種群的遺傳多樣性處于中等水平。在研究中雌黃連木的遺傳分化系數Gst為0.150 8，由分子變異方差分析（AMOVA）顯示，85.25%的變異存在于種群內，以上2個結果都表明：雌黃連木種群間存在較低的遺傳分化，且遺傳變異主要來源為種群內。基因流Nm為2.814 9，表明較高的基因流可能是導致雌黃連木具有中等遺傳多樣性的主要原因之一。

關鍵詞：黃連木；遺傳多樣性；遺傳分化；AFLP

中圖分類號： S567.1+90.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0116-03

收稿日期：2017-03-17

基金項目：國家自然科學基金（編號：31560217）；國家林業局西南風景園林工程技術研究中心建設項目；云南省高校重點建設學科（風景園林學）建設項目。

作者簡介：管 菊（1991—），女，云南宣威人，碩士研究生，主要從事園林植物研究。E-mail：630958865@qq.com。

通信作者：程小毛，博士，副教授，主要從事林木遺傳育種研究。E-mail：30375713@qq.com。 黃連木（Pistacia chinensis）是一種高效多油的落葉植物，富含不干性油[1]，是我國解決能源危機的重要能源樹種。黃連木抗性及適應性強，分布廣泛，是重要的山地造林樹種之一。我國部分區域有不少荒山貧瘠地，不宜耕作生產，而作為重要生物質能源的黃連木具有廣闊的種植空間[2]。同時，黃連木富含黃酮類、單寧、萜類及不飽和脂肪酸等生物活性成分，不僅可供食用，且是重要的藥用和材用樹種[3]。目前，黃連木的繁殖一般只能依靠種播，作為雌雄異株、以種子為重要利用部分的能源植物，黃連木雌株也就具有最直接的經濟價值[4]，因此，研究雌黃連木遺傳多樣性顯得尤為重要。

在眾多的分子遺傳標記中，擴增片段長度多態性（AFLP）指紋標記技術具有穩定高效、方便可靠、無需預先知道基因信息等特點，在物種資源管理和種群遺傳多樣性以及其他研究領域占有非常重要的地位[5-6]。本研究以河南省安陽市、長葛市2個地區共5個地點所采集的雌黃連木為試驗材料，首次采用AFLP標記技術，對其種群的遺傳關系進行研究，從而明確不同區域雌黃連木資源的遺傳多樣性水平和種群結構，以研究其變化規律，為將來雌黃連木種質鑒定、分類地位的確立提供科學依據，同時也為黃連木良種選育及廣泛推廣種植奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所采用的材料為2015年3月中旬在河南省安陽市、長葛市2個地區共5個地點采集的雌黃連木嫩葉，將不同地點的試驗材料作為1個種群處理，取樣地點分別在長葛市和安陽市的南溝村（西溝北坡）、南溝（東后凹）、南溝（西后凹）、安陽監獄，各個種群分別采樣59、16、14、20、30株，共139株個體，每株個體隨機采其嫩梢，單株取樣個體間間距保證在30 m以上，取樣后存入有硅膠干燥劑的自封袋中干燥保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 提取雌黃連木基因組DNA的方法為十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）改良法[7]，并適當修改。取雌黃連木干燥嫩葉6 g，用液氮迅速研磨成粉，加入600 μL CTAB提取液以及少量聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、15 μL β-巰基乙醇。搖勻后，迅速放入65 ℃水浴鍋中水浴45 min。后加入等體積三氯甲烷+異戊醇（體積比24 ∶ 1），上下顛倒混勻，離心16 min，取上清液，再加入等體積三氯甲烷+異戊醇（體積比24 ∶ 1），搖勻離心16 min。取上清液，加入10 μL RNase A酶。檢測DNA質量用1%瓊脂糖凝膠，檢測后將剩余DNA稀釋為50 ng/μL，放入-20 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 雌黃連木AFLP反應體系 AFLP反應體系參考程小毛等的方法[8]，于Gene Amp PCR system 9700（Applied 73 Biosystems）上進行。

1.2.2.1 酶切 每個反應總體積為25 μL，其中包括150 ng DNA，2.5 U Eco R Ⅰ，1.5 U MseⅠ，2.5 μL 10× Tango buffer，加ddH2O至12.5 μL。反應程序：37 ℃ 5 h，65 ℃ 2 h，85 ℃ 20 min。

1.2.2.2 連接 酶切后，每個DNA樣品中加入12.5 μL連接混合液（各5 μL Eco R Ⅰ、MseⅠ接頭，0.75 U T4 DNA連接酶，2.5 μL 10×T4 Buffer，加ddH2O至12.5 μL）。反應程序：22 ℃ 3 h，65 ℃ 10 min，反應結束后將產物稀釋5倍待用。

1.2.2.3 預擴增 取5 μL連接稀釋后的DNA樣品，各加入20 μL預擴增混合液，含2.5 μL 10×PCR Buffer（Mg2+），2 μL 2.5 μmol/L dNTP，1 μL 10 μmol/L primer，0.2 μL Taq DNA聚合酶，14.3 μL ddH2O。混勻后，按以下程序進行反應：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25個循環；72 ℃ 5 min。將預擴增產物稀釋20倍備用。

1.2.2.4 選擇性擴增 取2 μL預擴增稀釋混合液，各加入8 μL選擇性擴增混合液[1.0 μL 10× PCR Buffer（Mg2+），0.8 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 10 μmmol/L primer，0.1 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶，加ddH2O至8 μL]。混勻后，按以下程序反應：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，13個循環；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，23個循環； 72 ℃ 5 min；95 ℃ 5 min，結束后立刻用冰浴冷卻待用。AFLP引物與接頭序列見表1。endprint

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）檢測 PCR產物經6%聚丙烯酰氨凝膠電泳后，參照程小毛等的方法[9]進行銀染顯色，流水沖洗干凈，置于室內自然干燥后，在燈箱上拍照記錄并分析相關數據。

1.3 帶型統計與數據分析

使用人工讀帶的方法，將基因型轉化成數字矩陣，在同一水平線上，把電泳圖上較清晰的條帶記為“1”，同一位置不存在條帶或有不易分辨的弱帶記為“0”。采用POPEGENE version1.31進行分析和計算雌黃連木遺傳多樣性相關參數[10]；使用分子變異方差分析（AMOVA）軟件分析其遺傳分化及遺傳結構[11]。

2 結果與分析

2.1 雌黃連木AFLP遺傳多樣性分析

利用EA11MC1～EA11MC15、EA12MC1～EA12MC15、EA13MC1～EA13MC15、EA15MC1～EA15MC15、EA16MC1～EA16MC15引物組合的方式對雌黃連木基因池進行擴增。篩選出10對條帶清晰的引物組合，對5個不同地區的總計139份黃連木雌株的DNA樣品進行遺傳多樣性研究。表2顯示：10對引物的香農指數（I）最大為0.608 6（EA11-MC14），最小為0.284 6（EA13-MC12），平均值為0.492 7；觀測等位基因數（Na）最大值為2.000 0個，最小值為1.666 7個，平均值為1.876 0個；有效等位基因數（Ne）最大為1.772 8個（EA11-MC14），最小值為1.342 8個（EA13-MC12），平均值為1.592 6個；Nei基因多樣性指數He最大值為 0.422 5（EA11-MC14），最小值為0.190 6，平均值為 0.335 3。

通過對2個地區5個雌黃連木種群的遺傳多樣性分析顯示，在種群水平上長葛地區和安陽監獄雌黃連木種群的幾項遺傳多樣性指數均高于其他種群。5個種群的平均遺傳多樣性指數分別為Na=1.173 2，Ne=1.482 4，He=0.273 2，I=0401 0（表3）。

Neis多樣性指數He可以顯示各個種群的變異程度，由表3可見，長葛地區雌黃連木種群變異程度最高（0.338 8），南溝（西后凹）的種群變異程度最低（0.224 6）。從遺傳多樣性指數來看，長葛地區遺傳多樣性水平最高（Na=1.860 5，Ne=1.594 4，He=0.338 8，I=0.496 6）；南溝（西后凹）最低（Na=0.162 02，Ne=1.388 3，He=0.224 6，I=0.333 6）。

2.2 雌黃連木遺傳分化

雌黃連木不同種群的遺傳分化程度見表4，所得數據經POPGEN 分析表明， 本試驗中所調查的5個雌黃連木種群的總基因多樣性（Ht）為0.321 8，種群內基因多樣性（Hs）為 0.273 3，種群間遺傳分化系數（Gst）為0.150 8，表明雌黃連木種群間分化程度屬中度[12]。這與AMOVA的分析結果一致，即遺傳變異的85.25%發生在種群內，種群間占14.75%。以上二者結論都表明，雌黃連木遺傳變異主要發生在種群內。種群間的遺傳分化在0.001水平上達到顯著水平，種群間基因流Nm為2.814 9（Nm>1），說明種群間基因流水平較高，遺傳分化較小。

2.3 雌黃連木遺傳距離與相似度

通過對不同種群的雌黃連木的遺傳距離與相似度分析可知，遺傳距離最小的為長葛種群和安陽監獄種群，遺傳距離最大為南溝（東后凹）種群和南溝（西后凹），范圍在0.041 2～0.126 9之間。遺傳相似度最高的為長葛種群和安陽監獄種群，最低的為南溝（東后溝）種群和南溝（西后凹）種群，遺傳相似度范圍在0.880 8～0.959 6之間（表5）。

3 討論

基因變異，即遺傳資源基因的豐富程度，是生物遺傳多樣性的最直接的表現形式。本研究利用10對AFLP引物對河南省2個地區5個不同種群遺傳多樣性進行了分析，由結果可知：I=0.492 7、Ne=1.592 6、He=0.335 3，這個結果表明，黃連木雌株遺傳多樣性處于中等水平，與王超等利用隨機擴增微衛星多態性（RAMP）對黃連木進行遺傳多樣性研究的結果（I=0.380 3）[13]和吳志庒等利用簡單重復序列（SSR）對黃連木天然種群遺傳多樣性的研究結果（He=0.472）[14]相近；而低于郝麗娟利用SSR（He=0.545 8）對黃連木天然種群遺傳多樣性的研究結果[15]。導致AFLP、SSR標記結果存在差異的原因可能有以下幾點：（1）這2種分子標記技術的靶位點不相同，靈敏度不同，在分析過程中檢測到的遺傳信息不在同一位點，故導致結果不一致，但對于未知基因，AFLP技術檢測位點多，獲得更強的多態信息，結果更為準確[15]；（2）經過長期人工栽培，由于人工或自然選擇等因素使得雌黃連木產生了許多變異，從而使單純雌株的遺傳多樣性低于整個物種；（3）研究對象的取材地點和方法不一樣，造成結果有差異。在種群水平上，不同的黃連木雌株種群內遺傳多樣性水平也呈現出一定的差異。5個種群中長葛地區的遺傳多樣性最高，而南溝（東后凹）種群多樣性則最低。造成該結果的原因可能是各個種群所在地點不同，所存在的生態因子有一定差異，從而造成種群間遺傳多樣性有差異。

遺傳分化，即遺傳結構變異的分布格局的差異，是遺傳多樣性的重要體現，Gst值是反映種群進化歷史的重要指標，基因流Nm則是影響遺傳結構均質化的重要因子。在本研究中，5個不同黃連木雌株種群之間的遺傳分化系數Gst=0.150 8，所以種群間變異程度為15.08%，種群內遺傳變異程度為84.92%。該結果與眾多風媒傳粉的樹種變異模式一致[16]。本研究由Gst計算的種群間基因流Nm為2.814 9，可能發揮均質化作用[17]，使得黃連木種群間遺傳分化程度較低。

參考文獻：endprint