芽孢桿菌對肥胖大鼠腸道微生態的影響

李在建+王懷山+趙京楊+操繼躍

摘要：給大鼠飼喂高脂日糧，建立大鼠肥胖模型，以研究肥胖對腸道微生態的影響。給肥胖大鼠灌胃芽孢桿菌懸液，分別在芽孢桿菌處理試驗的第4周、第7周采樣，研究灌喂芽孢桿菌后肥胖大鼠腸道菌群結構的變化，以及芽孢桿菌對糞便中短鏈脂肪酸和大鼠體質量的影響。結果表明，芽孢桿菌能夠顯著提高其腸道菌群的多樣性，并且對肥胖動物的體質量控制起到一定的積極作用。

關鍵詞：肥胖；大鼠；肥胖抵抗；芽孢桿菌；腸道微生態

中圖分類號： S852.6 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0162-04

收稿日期：2016-04-14

基金項目：聊城大學博士啟動基金（編號：318051314）。

作者簡介：李在建（1986—），男，山東青州人，博士，講師，主要從事獸醫藥理學與生物制品學研究。Tel：（0635）8239936；E-mail：lizj8603@163.com。

通信作者：王懷山，男，碩士，獸醫師，主要從事動物微生態制劑方面的研究。E-mail：wanghuaishan@163.com。 近年來，肥胖人群的數量越來越大，肥胖及由其引起的一系列疾病已經嚴重影響到人類的生活質量。盡管有研究證明，某種類型的肥胖可能和機體的基因突變有關，但是人類的基因在短時期內很難發生特別大的改變，所以現在研究專家已經將研究的注意力轉移到可能導致肥胖的外界因素上[1-2]。有“人類第二基因”之稱的腸道微生物目前已經成為研究熱點，有研究表明，腸道微生物可以提高宿主從食物中攝取能量的效率并且能對脂肪代謝起調控作用，最終導致肥胖的產生[3]。所以，如何通過外界因素影響機體的腸道微生態進而達到控制肥胖的目的已經成為國際關注的焦點。益生菌作為腸道益生產品對腸道微生態的影響較大，它能明顯改變腸道的菌群結構，因此，通過益生菌調節腸道微生態來觀察其對肥胖的影響就成為了一個比較熱門的研究方向[4-5]。

本試驗首先建立大鼠肥胖模型研究肥胖與腸道微生態之間的關聯，然后通過給肥胖大鼠灌喂芽孢桿菌菌懸液，研究芽孢桿菌對肥胖大鼠腸道微生態、腸道微生物代謝產物（短鏈脂肪酸）及其體質量的影響，為研究芽孢桿菌對肥胖動物的益生作用提供新的依據，對如何通過外源性益生物質調節肥胖動物的腸道微生態進而對肥胖的影響有重要的研究意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

50只健康SD雄性大鼠，體質量100～200 g，無特定病原體（SPF）等級，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供；芽孢桿菌，由華中農業大學生理實驗室保存；基礎日糧，由同濟醫科大學實驗動物中心提供；高脂日糧，由60%基礎飼料、15%豬油、10%蛋黃粉、8%脫脂奶粉、5%干酪素、2%白砂糖組成。

1.2 主要試劑與設備

Tris飽和酚，北京鼎國昌盛生物科技有限責任公司生產；marker，北京鼎國生物技術有限公司生產；擴增所用引物，生工生物工程（上海）股份有限公司生產；色譜標準酸，上海化學試劑有限公司試劑一廠生產；高速低溫離心機，Eppendorf公司生產；水浴鍋，常州國華電器有限公司生產；電熱恒溫培養箱，上海博遠實業有限公司生產；PCR儀，廣東東盛生物科技有限公司生產；變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）系統（D-Code），Bio-Rad公司生產；氣相色譜儀（Trace-GC2000），美國熱電集團生產。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗動物處理 50只大鼠于同濟醫科大學動物實驗中心飼養，肥胖模型建立期間把大鼠隨機分成2個組：陰性對照組（20只，飼喂基礎日糧）、模型組（30只，飼喂高脂日糧）。各組自由飲水、采食。以飼喂高脂日糧組大鼠體質量達到正常大鼠體質量120%以上為肥胖模型建立成功的標準[6]。肥胖模型建立成功后進入芽孢桿菌灌喂期，進入灌喂期再將陰性對照組分出10只大鼠作為陰性芽孢桿菌組，將模型組分為3組：10只肥胖模型組、10只肥胖芽孢桿菌組、10只肥胖抵抗組（飼喂奧利司他）。陰性芽孢桿菌組和肥胖芽孢桿菌組在灌喂期間的灌喂量為每次灌喂芽孢桿菌菌懸液1 mL/只（1×107 CFU/mL），每天灌喂1次，持續45 d。其他各組按相同時間和相同劑量灌喂蒸餾水。

1.3.2 采樣 在肥胖模型建立前首先采集1次大鼠的糞便，此后每周采集1次各組大鼠的糞便，所有樣品立即在-20 ℃冷凍保存備用。

1.3.3 ERIC-PCR分析 參照Gordon等的報道[7]，引物序列為ERIC-1：5′-ATGTAAGCTCCTGGG GATTCAC-3′，ERIC-2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，細菌基因組重復序列PCR技術（ERIC-PCR）擴增體系如表1所示。

反應條件：95 ℃ 7 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，65 ℃ 8 min，30個循環；65 ℃ 16 min。取1 μL PCR擴增產物測定濃度。然后使用1.5%瓊脂糖凝膠在180 V電壓下電泳約 50 min 得到相應的圖譜，每個樣品的上樣量約為400 ng。最后使用凝膠成像系統對凝膠進行拍照。

1.3.4 糞便中短鏈脂肪酸（SCFA）的測定 準確稱取0.5 g糞便樣品于7 mL離心管中，然后加入0.5 mL純水，渦旋混勻3 min，15 000 r/min、4 ℃離心20 min，取0.5 mL上清液于另一離心管中，加入100 μL 25%偏磷酸，混勻3 min，4 ℃放置過夜，取出后15 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液稀釋100倍后供氣相色譜分析[8]。

1.4 數據處理與分析

利用Quantity One v4.4軟件將試驗所得凝膠上的條帶進行非加權平均距離（UPGMA）聚類分析、相似度分析等。試驗所得數據采用SPSS 11.0進行統計分析，數據均采用“平均數±標準誤差”表示。endprint

2 結果與分析

2.1 肥胖模型建立結果

由表2可知，與肥胖模型組相比各組大鼠體質量均差異極顯著（P<0.01）。

2.2 ERIC-PCR結果

2.2.1 肥胖大鼠腸道微生物的ERIC-PCR結果 由圖1可知，建模前、后陰性對照組的主條帶并無明顯差異，許多明亮的主條帶屬于2組共有，但是肥胖模型組的主條帶卻發生了比較大的變化，多條原本灰暗的條帶在建模成功后變成了明亮的主條帶，并且在建模前、后模型組條帶的多樣性明顯增多。這說明，肥胖對腸桿菌的影響比較明顯，不但可以增高其多樣性，還能增加其數量。

2.2.2 各處理對大鼠腸道微生態影響的ERIC-PCR結果 由圖2可知，在芽孢桿菌處理第4周時（圖2-a），各組條帶的多樣性較高，有些明亮的條帶所有組均具備，但是不同組之間的優勢條帶存在差異。肥胖模型組和肥胖芽孢桿菌組無論從條帶的數目還是條帶的亮度上都要優于其他各組。與陰性對照組相比，肥胖抵抗組明亮條帶的數目明顯較少。在芽孢桿菌處理第7周時（圖2-b），陰性對照組和肥胖芽孢桿菌組的條帶比較集中，明亮的條帶較多，肥胖鼠經芽孢桿菌處理后，其條帶的多樣性增加。而肥胖抵抗組條帶的數目明顯下降，亮條帶也基本消失。這說明，芽孢桿菌對肥胖大鼠腸桿菌菌群的影響是比較明顯的， 它能增加其腸桿菌的多樣性和數量。在這2個時間點，肥胖抵抗組大鼠腸桿菌的多樣性和數量均低于肥胖模型組大鼠。

由圖3可知，在芽孢桿菌處理第4周時（圖3-a），陰性對照組和肥胖芽孢桿菌組大鼠之間的腸桿菌菌群已經開始出現輕微的差異性。肥胖抵抗組跟陰性對照組相比也表現出一定的差異性，但不是十分明顯。在芽孢桿菌處理第7周時（圖3-b），肥胖抵抗組和肥胖芽孢桿菌組之間存在一定的差異。陰性對照組和肥胖芽孢桿菌組也表現出比較明顯的差異。上述結果表明，肥胖大鼠腸桿菌的菌群結構受芽孢桿菌的影響比較大，到第7周時，其菌群結構發生的改變已經非常明顯。而肥胖抵抗大鼠腸桿菌的菌群結構與肥胖鼠相比差異性隨時間變化逐漸增大。

2.3 大鼠糞便中SCFA的測定結果

2.3.1 大鼠糞便中SCFA的色譜圖分析結果 由圖4可知，與標準品的色譜圖相比，各試驗組樣品色譜圖的各個峰之間沒有疊加，分離良好。

2.3.2 試驗處理對大鼠糞便中SCFA的影響及其分析 由表3可知，陰性對照組糞便中總SCFA的含量為（19.50±1.96） μg/mL，其中乙酸的含量最多，丙酸、丁酸的含量次之；肥胖模型組糞便中SCFA含量為（25.33±1.99） μg/mL，顯著高于陰性對照組（P<0.05），其中乙酸的含量為（20.52±1.83） μg/mL，顯著高于陰性對照組乙酸的含量（P<0.05）；另外，與肥胖模型組相比，肥胖抵抗組樣品糞便中SCFA總量和乙酸的含量均差異極顯著（P<0.01）， 丙酸的含量顯著降低（P<0.05），而丁酸的含量略有升高；肥胖大鼠在芽孢桿菌作用下其糞便中SCFA的總含量、乙酸、丁酸的含量均有不同程度的升高，但變化不顯著。這些試驗結果間接反映出大鼠

腸道厭氧菌菌群的變化情況，大鼠肥胖后其腸道厭氧菌菌群的結構變化明顯，可能是總菌量增加或菌的活性增高；芽孢桿菌可以改善肥胖大鼠腸道厭氧菌的菌群結構， 但是這種作用不明顯。另外，與肥胖模型組大鼠相比，肥胖抵抗組大鼠腸道厭氧菌的數量或活性都明顯偏低，說明兩者腸道厭氧菌菌群的結構差異性較大。

4 討論

本試驗結果表明，芽孢桿菌不僅可以改變肥胖大鼠腸道微生物數量，還能夠影響菌群的種類。芽孢桿菌能夠增加腸道菌群結構的多樣性，這種調節作用的直接后果就是降低了肥胖大鼠的體質量，數據顯示，給肥胖大鼠飼喂適量的芽孢桿菌4周后，其體質量明顯下降。這說明外源性芽孢桿菌能夠改變肥胖大鼠的腸道菌群結構，增高其菌群多樣性并能增加菌群的數量，通過這種對腸道微生態的調節作用，可以達到控制其肥胖體質量的目的[9-10]。進一步說明，外源性芽孢桿菌和肥胖大鼠內源性腸道菌相互作用可以給肥胖大鼠腸道微生物的能量代謝帶來較大的影響，進而影響體內脂肪的堆積程度，最終改變了肥胖大鼠的體質量。

肥胖模型組大鼠糞便中各種SCFA的含量均明顯高于陰性對照組，說明在肥胖的形成過程中其糞便中SCFA的含量逐漸升高；肥胖抵抗組大鼠糞便中各種SCFA的含量明顯偏低于肥胖模型組大鼠，說明動物的肥胖程度與其糞便中短鏈脂肪酸含量之間呈現一種正相關的關系。這從側面反映出肥胖可能改變了腸道厭氧菌群的結構，增加了厭氧菌的數量或增強了厭氧菌的活性，從而使厭氧菌的代謝產物SCFA含量隨之增加。其原因可能是高脂飲食的攝入改變了腸道內厭氧菌的發酵底物，而這種發酵底物正好適合厭氧菌的生活特性，因此，該發酵產物可能刺激厭氧菌增加了其發酵活性，也有可能是增加了厭氧菌的總量[11-12]。

肥胖與腸道微生態之間有直接的聯系，動物肥胖后腸道菌群結構會發生較大的變化，并有新的優勢菌群產生，至于該優勢菌群的種屬還有待于做進一步的鑒定；芽孢桿菌能改變肥胖動物的腸道菌群結構，明顯提高其菌群多樣性，通過這種調節作用能夠對肥胖動物的體質量控制起到一定的積極影響[13]。

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