小肽氨基酸組成對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織乳蛋白合成的影響

周苗苗+崔景香

摘要：為研究不同二肽對(duì)奶牛乳腺組織中乳蛋白合成的影響，在體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織培養(yǎng)液中分別添加不同的賴氨酸二肽：賴氨酸-賴氨酸（Lys-Lys）、賴氨酸-組氨酸（Lys-His）、賴氨酸-苯丙氨酸（Lys-Phe）、賴氨酸-亮氨酸（Lys-Leu）和賴氨酸-蘇氨酸（Lys-Thr），等量取代培養(yǎng)液中10%游離賴氨酸（賴氨酸總濃度為210 μg/mL）進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)束后收集乳腺組織和培養(yǎng)液分別檢測(cè)基因表達(dá)和乳蛋白合成。結(jié)果表明，同游離Lys和Lys-Thr、Lys-Lys、Lys-His二肽相比，Lys-Leu和Lys-Phe顯著提高了乳腺組織中αs1酪蛋白基因的表達(dá)（P<0.05）；5種肽結(jié)合Lys均顯著提高了小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體2（PepT2）的mRNA豐度（P<0.05），Lys-Phe和Lys-Leu比等量的Lys-Thr、Lys-Lys和Lys-His更能促進(jìn)PepT2基因的表達(dá)（P<0.05）。說(shuō)明小肽不同的氨基酸組成可影響奶牛小肽的攝取和乳蛋白的合成，同親水性氨基酸組成的小肽相比，疏水性氨基酸組成的小肽更能促進(jìn)乳腺αs1酪蛋白基因的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：小肽；氨基酸；賴氨酸二肽；乳蛋白；小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體2；奶牛乳腺組織；豐度；αs1酪蛋白基因

中圖分類號(hào)： S823.9+11 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）18-0166-02

收稿日期：2016-04-29

基金項(xiàng)目：山東省濰坊市科技發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2015GX077）。

作者簡(jiǎn)介：周苗苗（1983—），女，山東聊城人，博士，副教授，主要從事反芻動(dòng)物泌乳生理研究。E-mail：zhoumm0329@163.com。 乳腺組織能攝取血液循環(huán)中的小肽（2～3個(gè)氨基酸組成）作為乳蛋白合成的前體物質(zhì)，小肽在反芻動(dòng)物乳腺蛋白合成中發(fā)揮重要作用[1-2]。很多研究證實(shí)，給體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中添加適當(dāng)濃度的必需氨基酸如蛋氨酸（methionine，Met）、賴氨酸（lysine，Lys）、纈氨酸（valine，Val）、亮氨酸（leucine，Leu）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、蘇氨酸（threonine，Thr），小肽均能促進(jìn)酪蛋白的基因表達(dá)和乳蛋白合成[3-9]。目前關(guān)于小肽添加量對(duì)乳蛋白合成的影響研究較多，而小肽的氨基酸組成對(duì)乳蛋白合成影響的研究較少。因此，本試驗(yàn)初步探討了不同氨基酸組成的含Lys二肽對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織乳蛋白合成的影響。

1 材料與方法

1.1 奶牛乳腺組織體外培養(yǎng)

取泌乳中期的中國(guó)荷斯坦奶牛乳腺組織，清洗并剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小。將組織塊種植于6孔板上，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中（37 ℃，5%CO2），待組織貼壁后每孔添加2 mL培養(yǎng)液。培養(yǎng)液成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM（dulbeccos modified eagles medium）-F12（Gibco，美國(guó)）添加1%谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、5 μg/mL 胰島素（Sigma，美國(guó)）、500 ng/mL催乳素（Sigma，美國(guó)）、1 μg/mL氫化可的松（Sigma，美國(guó)）以及10%胎牛血清（FCS，杭州四季青生物工程公司）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)處理培養(yǎng)液中去除胎牛血清、補(bǔ)充幾種必需氨基酸[Phe、Met、Lys、Leu、Val、異亮氨酸（isoleucine，Ile）、蘇氨酸（threonine，Thr）、組氨酸（histidine，His）]，并按試驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)整相應(yīng)氨基酸和小肽的濃度。分別用培養(yǎng)液中Lys總量（210 μg/mL）10%肽結(jié)合Lys[Lys-Lys/（LL）、Lys-His/（LH）、Lys-Phe/（LP）、Lys-Leu/（LU）、Lys-Thr/LT]替代等量的Lys。試驗(yàn)處理48 h后，分別收集乳腺組織和培養(yǎng)液用于總RNA提取和總蛋白含量測(cè)定。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3 RNA提取和cDNA合成

用Trizol（Invitrogen，美國(guó)）提取組織中的總RNA。RNA純度以紫外吸光法檢測(cè)（D260 nm/D280 nm>1.80）。抽提的RNA溶解后立即用于第1鏈cDNA的合成（PrimeScriptTM RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa）。合成的cDNA貯存于-20 ℃，備用。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)mRNA的表達(dá)。αs1酪蛋白、小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體2（oligopeptide transporter 2，PepT2）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的實(shí)時(shí)熒光定量專用引物見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，反應(yīng)體系為2 μL cDNA模板+18 μL PCR反應(yīng)液（SYBR Premix Ex TaqTM Real Time PCR試劑盒，TaKaRa）。純水替代cDNA模版作為陰性對(duì)照。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，40個(gè)循環(huán)；60 ℃ 34 s。ABI7 500實(shí)時(shí)定量序列檢測(cè)軟件（Applied Biosystems，美國(guó)）自動(dòng)讀取循環(huán)數(shù)（CT）值，GAPDH、αs1酪蛋白和PepT2的擴(kuò)增效率分別為100.9%、100.1%、101.3%，mRNA相對(duì)變化值用公式2-ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算。

1.5 DNA總量和培養(yǎng)液中總蛋白質(zhì)含量測(cè)定

用Trizol提取組織中的DNA總量，用紫外吸光度法測(cè)定DNA的純度（D260 nm/D280 nm>1.80）和含量。DNA含量作為“組織數(shù)量/細(xì)胞數(shù)量”的代表，用于校正培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)

含量。將冷的丙酮沉淀培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)溶于含1 mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，隨后根據(jù)Bradford的方法[9]用蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒（博士德，武漢）檢測(cè)培養(yǎng)液中的總蛋白質(zhì)含量，并以此代表培養(yǎng)液中的乳蛋白含量。以試驗(yàn)組DNA校正乳蛋白含量[蛋白質(zhì)質(zhì)量（mg）同DNA質(zhì)量（μg）的比值]同對(duì)照組DNA校正乳蛋白含量的比值作為最終結(jié)果進(jìn)行比較。endprint

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行處理，用SAS軟件 PROC-GLM 程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

同游離Lys和其他Lys二肽相比，Lys-Leu、Lys-Phe可顯著提高乳腺組織中αs1酪蛋白基因的表達(dá)（P<0.05），其中Lys-Phe組αs1酪蛋白mRNA豐度最高（圖1-A）。同對(duì)照組相比，Lys二肽替代組乳蛋白合成量差異不顯著（圖1-B）。

5種肽結(jié)合Lys的添加均顯著提高了PepT2的mRNA豐度（P<0.05，圖2）。不同氨基酸殘基組成的小肽對(duì)PepT2基因表達(dá)的影響不同。由圖2可見(jiàn)，Lys-Phe和Lys-Leu比等量的Lys-Thr、Lys-Lys和Lys-His更能促進(jìn)PepT2基因的表達(dá)（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，影響因素較多。除肽鏈長(zhǎng)度外，肽的氨基酸殘基組成是影響肽吸收的另一個(gè)重要因素。一般而言，L型氨基酸組成的小肽要比D型氨基酸組成的小肽更易吸收；中性氨基酸組成的小肽比酸堿性氨基酸組成的小肽更易被動(dòng)物吸收。在本試驗(yàn)中，同Lys-His、Lys-Thr、Lys-Lys相比，Lys-Leu、Lys-Phe顯著增加了乳腺組織中αs1酪蛋白mRNA豐度（P<0.05）。分析小肽的氨基酸組成可以發(fā)現(xiàn)，同親水性和帶電荷的氨基酸殘基（如Thr、Lys和His）組成的小肽相比，疏水性和體積較大的氨基酸殘基（如Phe和Leu）組成的小肽更能促進(jìn)乳腺中αs1酪蛋白的基因表達(dá)和乳蛋白合成。這些結(jié)果表明，小肽在促進(jìn)乳蛋白合成方面的效果受其氨基酸組成的影響。

小肽的吸收主要依賴于小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體包括PepT1和PepT2。在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中則僅有PepT2表達(dá)[7]。這些肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)不僅可以轉(zhuǎn)運(yùn)小肽，還可以轉(zhuǎn)運(yùn)與肽結(jié)構(gòu)類似的藥物。與氨基酸（AA）轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制不同，小肽是逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)，而且主要依賴H+或Ca2+濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。與游離氨基酸（FAA）吸收慢、吸收時(shí)耗能高相比，小肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)具有轉(zhuǎn)運(yùn)速度快、耗能低等特點(diǎn)。小肽與FAA相互獨(dú)立的吸收機(jī)制，有助于減輕由于FAA相互競(jìng)爭(zhēng)共同吸收位點(diǎn)而產(chǎn)生的吸收抑制。小肽載體對(duì)底物具有廣泛的適應(yīng)性，幾乎能夠轉(zhuǎn)運(yùn)所有的二肽和三肽[10]。但肽載體對(duì)底物構(gòu)象具有嚴(yán)格的特異性，它對(duì)N末端含D型AA的耐受性比C末端為D型的高，而全D型的肽不能作為底物。另外，小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)由疏水性和體積較大的氨基酸殘基組成的小肽具有高親和力；而對(duì)由親水性和帶電荷的氨基酸殘基組成的小肽親和力較低[11]。本試驗(yàn)中5種肽結(jié)合Lys的添加均顯著提高了PepT2的mRNA豐度（P<0.05）。PepT2是一種底物親和力高，但易飽和的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾樱瑫r(shí)乳腺組織又有攝取小肽的需求時(shí)，只能通過(guò)增加PepT2的數(shù)量來(lái)實(shí)現(xiàn)。PepT2在奶牛乳腺小肽攝取過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其蛋白數(shù)量同其轉(zhuǎn)運(yùn)小肽的多少呈正相關(guān)關(guān)系[6，12]。因此，PepT2的表達(dá)增強(qiáng)也說(shuō)明了乳腺對(duì)小肽的攝取增加。此外，不同氨基酸殘基組成的賴氨酸小肽對(duì)PepT2基因表達(dá)的影響不同。Lys-Phe和Lys-Leu比等量的Lys-Thr、Lys-Lys、Lys-His更能促進(jìn)PepT2基因的表達(dá)（P<005）。這一結(jié)果同Lys-Phe和Lys-Leu對(duì)αs1酪蛋白的基因表達(dá)影響結(jié)果一致。以上結(jié)果說(shuō)明，小肽不同的氨基酸殘基組成可以影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞小肽的攝取，進(jìn)而影響乳蛋白的合成。

Lys-Lys、Lys-His、Lys-Leu、Lys-Phe、Lys-Thr對(duì)奶牛乳腺組織乳蛋白合成的促進(jìn)作用依賴于其氨基酸殘基的理化性質(zhì)。同親水性氨基酸組成的小肽相比，疏水性氨基酸組成的小肽更能促進(jìn)乳腺αs1酪蛋白基因的表達(dá)。

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