甘薯幾丁質酶的分離與純化

劉美艷+王景景+謝逸萍+張健

摘要：以高抗甘薯黑斑病品種南京-92塊根為材料，從染菌6 d的甘薯塊根中得到粗酶液；經熱變性、硫酸銨分級沉淀后，采用高流速二乙基氨基瓊脂糖交換劑 （DEAE Sepharose Fast Flow）陰離子交換層析，分離出3個蛋白峰，活性檢測可知峰2為活性峰；將峰2經葡聚糖凝膠G - 75（SephadexG-75）凝膠層析純化后得到4個蛋白峰；將具有幾丁質酶活性的峰2經聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），凝膠上顯示2條蛋白條帶，分別割膠純化測定活性，然后將有活性的條帶進行10%、12% PAGE電泳，均顯示為單一條帶；本試驗分離純化過程中得到了電泳純級的幾丁質酶，為后續的研究奠定了基礎。

關鍵詞：甘薯；黑斑病；幾丁質酶；分離；純化

中圖分類號： S435.313+.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0186-03

收稿日期：2016-03-25

基金項目：國家甘薯產業技術體系協作課題（編號：CARS-11-B-09-A）；江蘇省高校優勢學科建設工程資助項目。

作者簡介：劉美艷（1969—），女，江蘇徐州人，碩士，副教授，主要從事生物化學與分子生物學方面的研究。E-mail：liumeiyan@jsnu.edu.cn。

通信作者：張 健，碩士，副教授，主要從事植物生理學方面的教學與科研工作。E-mail：zhangjian@jsnu.edu.cn。 甘薯（Iomoea batatas Lam）別稱番薯、紅薯、山芋等，屬旋花科甘薯屬。甘薯的營養價值很高，我國的種植面積占世界種植面積的一半以上。甘薯黑斑病是由子囊菌亞門長喙殼菌屬（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted）侵染引起的真菌病害，是嚴重危害甘薯生產的主要病害，產量損失高達 20%～50%[1]。黑斑病的侵染能力極強，病菌通過破壞細胞壁，侵入甘薯細胞，在甘薯的幼苗生長階段和地窖儲藏階段均能使甘薯染病[2]。黑斑病的預防和控制已成為甘薯種植和儲藏研究中的重要任務之一。目前對甘薯抗黑斑病的研究主要集中在篩選抗病品種和雜交育種方面，對甘薯抗黑斑病機制方面的研究較少[3-4]。幾丁質酶是廣泛存在于微生物和植物體內的一類蛋白質，能水解真菌細胞壁中的幾丁質，從而抑制真菌的生長增殖，提高植物的抗真菌能力，是一類重要的病程相關蛋白（pathogenesis-related proteins，簡稱PP）[5-6]。本試驗的前期工作表明，甘薯塊根幾丁質酶是一種誘導酶，核黃素、脫乙酰幾丁質、黑斑病菌處理均能誘導甘薯塊根幾丁質酶活性的提高，甘薯幾丁質酶與甘薯抗黑斑病有著密切的關系[7]。因此，本試驗分離純化幾丁質酶、探究甘薯幾丁質酶的生理特性，以期從病程相關蛋白角度探究甘薯對黑斑病的抗性機制，同時也能為甘薯幾丁質酶進行末端測序、克隆甘薯幾丁質酶基因做準備。

1 材料與方法

1.1 供試材料及薯塊染菌處理

供試甘薯品種南京-92（高抗黑斑病），甘薯黑斑病病原物由江蘇徐州農業科學院中國甘薯研究中心提供。黑斑病菌懸浮液的制備按照王景景等的方法[4]進行。選取正常無病斑薯塊，用自來水沖洗干凈，晾干。將塊根切成1.5 cm厚度的圓片，將0.1 mL黑斑病菌內分生孢子接種于塊根圓片的表面，放置于28 ℃恒溫箱中培養，以蒸餾水處理的切傷塊根圓片為傷害對照組。

1.2 幾丁質酶的提取和活力測定

去除甘薯外表層，切成小塊，并迅速將其浸泡于 0.02 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH值5.5）中，甘薯質量和緩沖液的比例為1 ∶ 1（質量濃度），用組織搗碎機將甘薯磨碎，4層紗布過濾，濾液4 ℃、8 000 r/min、離心15 min，上清即為幾丁質酶粗酶液。膠體幾丁質的制備按照李世貴等的方法[8]進行。3，5-二硝基水楊酸（DNS）溶液的配制按照李合生的方法[9]進行。幾丁質酶活力測定參照Boller等的方法[10]進行。以1 h分解膠體產生1 μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為1個酶活性單位（U/mL）。

1.3 甘薯幾丁質酶的純化過程

從染菌6 d的1 000 g甘薯塊中得粗酶液800 mL，50 ℃水浴中熱變性30 min，10 000 r/min冷凍離心10 min；于上清液中加入硫酸銨使溶液達到20%飽和度，4 ℃下放置24 h，10 000 r/min 冷凍離心10 min，取上清，加入硫酸銨使溶液達到60 %飽和度，4 ℃下放置24 h，10 000 r/ min 冷凍離心 10 min，保留沉淀，加入少量緩沖液，搖勻；透析脫鹽；將透析脫鹽后的酶液依次經高流速二乙基氨基瓊脂糖交換劑 （DEAE Sepharose Fast Flow）陰離子交換層析，葡聚糖凝膠G-75（Sephadex G - 75）凝膠過濾，分別收集洗脫峰，檢測其活性，并將具有幾丁質酶活性的洗脫峰進行超濾濃縮；之后將純化濃縮的樣品經不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE，分離膠濃度5%，濃縮膠濃度12%），經染色后切取電泳膠上的蛋白條帶，將這些蛋白條帶浸泡在1.0 mL pH值為7.9的 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液中，盡量搗碎，4 ℃浸泡36 h，離心取上清，測定幾丁質酶活性；最后經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測純度幾丁質酶。

2 結果與分析

2.1 純化過程中甘薯幾丁質酶活性的變化

對分離純化過程每一個階段的甘薯幾丁質酶的活性進行比較。可以看出，隨著分離純化過程的深入，甘薯幾丁質酶的活性不斷升高，表明甘薯幾丁質酶逐步得到純化（表1）。

2.2 DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析結果endprint

DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析洗脫曲線結果如圖1所示，可以看出共分離出3個蛋白峰，活性檢測可知峰2為活性峰，收集該峰，透析、超濾、離心濃縮。

取具有幾丁質酶活力的峰2濃縮樣品進行SDS-PAGE，結果見圖2，酶液得到初步純化。

2.3 Sephadex G-75凝膠層析結果

將DEAE Sepharose Fast Flow得到的活性峰2經 Sephadex G-75凝膠層析純化后得到4個蛋白峰（圖3），活性檢測發現峰2具有幾丁質酶活性。

取具有幾丁質酶活力的峰2濃縮樣品進行SDS-PAGE，結果見圖4，酶液得到進一步純化。

2.4 割膠純化PAGE結果

將經Sephadex G-75凝膠層析純化后的樣品進行10%、12% PAGE，由圖5、圖6的泳道1可見，在12%、10%PAGE膠上都呈現2條蛋白條帶。將上下2條蛋白條帶分別割取純化后，測定活性，結果顯示下面蛋白條帶有幾丁質酶活性。將有活性的條帶進行12%、10%PAGE電泳，圖5、圖6的泳道2顯示12%、10% PAGE均為單一條帶。由此可以得出，經電泳制備得到了電泳純級的甘薯幾丁質酶單一組分。

3 結論與討論

目前，生產上控制甘薯黑斑病的主要方法以藥物防治為主，但農藥殘留會造成嚴重的環境污染及食品安全問題[11-12]。因此培育和栽培抗性品種是最經濟有效的方法。前期利用黑斑病菌對不同抗性品種甘薯幾丁質酶進行誘導的試驗結果表明，甘薯幾丁質酶是一種誘導酶，高抗品種甘薯塊內的幾丁質酶比高感品種積累的量多，2個品種幾丁質酶活性最大時達到極顯著差異，這與前人的研究結果[7，13]一致。說明甘薯幾丁質酶與甘薯抗黑斑病有著密切的關系，幾丁質酶對甘薯抵抗黑斑病的侵染具有重要作用。

植物細胞壁不含幾丁質，植物的幾丁質酶通過水解真菌的菌絲生長點細胞壁中的幾丁質以抵御病原菌侵染，因此幾丁質酶被普遍認為是一種與抗病有關的酶[14]。作為一種誘導型表達的病程相關蛋白，幾丁質酶已經在一些植物上表現出抗真菌活性[15-16]。隨著分子生物學技術的迅速發展，許多植物幾丁質酶已被克隆并被成功轉化，過表達幾丁質酶基因的轉基因植株擁有更強的抵御病原體入侵的能力，幾丁質酶能在抵御病原菌侵染中發揮重要的作用[17-19]。本試驗首次從甘薯塊根內純化得到1種幾丁質酶，為后續開展甘薯幾丁質酶性質、功能鑒定及甘薯抗黑斑病基因工程的研究奠定了基礎。

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