響應曲面法與正交法在二氧化碳超臨界萃取桑葉總黃酮中的比較

繆偉偉+王志雄+石仝雨+大野優子

摘要：為探索桑葉中總黃酮提取的最佳方案，利用超臨界二氧化碳萃取技術，依次用響應曲面法和正交試驗法考查萃取壓強、萃取溫度、萃取時間、夾帶劑無水乙醇的流速對桑葉中總黃酮得率的影響，優選出桑葉黃酮類化合物在使用超臨界萃取裝置時提取的最佳工藝。結果發現，正交試驗的最佳萃取條件為萃取壓強25 MPa，萃取溫度40 ℃，萃取時間3 h，夾帶劑無水乙醇流速2.5 mL/min，在此試驗條件下總黃酮得率為（6.18±0.05）%；響應曲面法的最佳提取率方案為壓強26.75 MPa，溫度50 ℃、時間3 h、流速2.61 mL/min，預期的總黃酮得率為6.20%，驗證試驗的總黃酮得率為（6.21±0.05）%。結果表明，響應曲面法及正交試驗法優化工藝后所得的總黃酮萃取率分別為（6.21±005）%、（6.18±0.05）%，可以看出響應曲面法優化所得條件的黃酮萃取率大于正交試驗法，但是不顯著；正交試驗只能得到總黃酮萃取中各因素不同水平之間的最優組合，不能考察到組合外的情況；響應曲面法通過構建二次回歸模型，不僅可以得到各因素對黃酮得率的影響大小及顯著性，還能找出試驗設置水平之外的最優萃取工藝，且最優萃取工藝的總黃酮提取率要優于正交試驗法，但是兩者的差距并不明顯。

關鍵詞：桑葉；超臨界萃取技術；總黃酮得率；響應曲面法；正交試驗法

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0189-05

收稿日期：2017-03-03

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金（編號：81402030）。

作者簡介：繆偉偉（1988—），女，江蘇鹽城人，碩士，助理工程師，研究方向為生物工程。E-mail：miaoww@sumhs.edu.cn。

通信作者：王志雄，博士，副教授，研究方向為生物工程。E-mail：wangzx@sumhs.edu.cn。 桑葉是我國傳統中藥之一，為桑屬植物桑樹（Morus alba L.）的葉片，曾被記載于《神農本草經》中，中醫又稱神仙草、鐵扇子。桑葉性甘、寒，甘可以益血，寒可以涼血，甘寒相合，故下氣而益陰，主治風熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭疼、目赤昏花等癥[1-4]。研究發現，桑葉中含有多種功能性成分，如礦物質、維生素、食物纖維、氨基酸、植物甾醇、黃酮類、生物堿類、多糖等。其中黃酮類化合物具有顯著的抗癌、抗氧化作用，受到人們的廣泛關注，其抗腫瘤作用主要表現在抗癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡和增強抑癌基因活性及抑制癌基因表達等方面[5-7]。超臨界二氧化碳流體（supercritical CO2 fluid extraction，簡稱SFE-CO2）萃取方法是一種新興技術，目前在國際上屬于最先進的物理萃取分離技術，萃取方法主要利用高滲透性和高溶解能力來提取分離成分，用到的溶劑是二氧化碳，以二氧化碳為溶劑，與一般的液體溶劑萃取相比，超臨界二氧化碳萃取在速度和范圍上更占優勢[8-10]。綜上所述，本研究運用響應曲面法分析超臨界萃取中桑葉總黃酮提取的關鍵因素，并獲得其最佳提取條件，能為進一步開發和利用桑葉中的總黃酮成分提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料、藥品 桑葉干粉（日本野姬和株式會社），蕓香苷標準品（上海金穗生物公司），無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉（上海金穗生物公司），氫氧化鈉（上海沃凱化學試劑有限公司），均為國產分析純。

1.1.2 器材 容量瓶，量筒，移液槍，離心管，過濾器，漏斗，濾紙，石英比色杯等。紫外可見光分光光度計（756P，上海光譜儀器有限公司），超臨界二氧化碳流體萃取設備（美國Waters公司），恒溫水浴箱（CV-420，上海恒一精密儀器有限公司），超純水系統（RE-100，上海本昂科學儀器有限公司），電子天平（FA2104，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝路線 稱取干燥后的桑葉粉2 g，裝入超臨界萃取裝置的萃取釜中，以無水乙醇為夾帶劑。在本試驗中通過改變相關萃取參數，完成相關萃取，獲得總黃酮提取液，計算得總黃酮提取率。具體步驟如下：

桑葉→干燥→稱量→超臨界萃取→總黃酮提取液→測定總黃酮提取率

1.2.2 標準曲線的繪制 精確稱取干燥至恒質量的蕓香苷標準品5.0 mg，用無水乙醇超聲溶解，搖勻，定容至50 mL，使之成為濃度100 μg/mL蕓香苷標準品溶液。精確量取上述溶液0、1、2、3、4、5 mL，加5%亞硝酸鈉水溶液0.3 mL，放置 6 min，加10%硝酸鋁0.3 mL，混勻后放置6 min，加入1%氫氧化鈉溶液4 mL，混勻，放置15 min后，加無水乙醇定容至10 mL，靜置15 min，等待顯色后用紫外-可見分光光度計在510 nm波長處測吸光度。以蕓香苷標準品濃度為橫坐標、510 nm處的吸光度為縱坐標作圖，繪制標準曲線（圖1）。

1.2.3 總黃酮提取率數理公式 量取1 mL桑葉提取液， 按

繪制蕓香苷標準曲線的步驟顯色，于510 nm波長處測定吸光度，計算提取液中總黃酮的濃度，再根據以下公式，得到總黃酮提取率：

總黃酮提取率=C×Vm×100%。

式中：C表示提取液總黃酮的濃度（mg/mL）；V表示提取液定容后的體積（mL）；m表示稱取的樣品桑葉干粉的質量（mg）。

1.2.4 單因素試驗 根據文獻[8-10]可得，影響總黃酮得率的主要因素有萃取溫度、萃取壓強、萃取時間和夾帶劑流速。本研究中采用這4個因素進行單因素試驗，分別考察各因素對桑葉總黃酮得率的影響，具體見表1。

1.2.5 正交試驗設計 以單因素試驗為基礎，建立4因素3水平的正交試驗，分析上述因素對總黃酮得率的影響，設計見表2。endprint

1.2.6 響應曲面試驗設計 依據最佳單因素條件，根據 Box-Behnken 中心組合試驗設計原理采用4因素3水平的響應曲面法對桑葉提取總黃酮工藝條件進行分析和優化。具體因素編碼及因素水平見表3。

1.2.7 試驗數據分析 通過SPSS 19.0軟件進行統計分析處理，通過Design Expert 8.0.6軟件進行響應曲面試驗的設計和統計分析，采用Sigmaplot10.0和Excel 2007作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

根據表1中的單因素試驗設計所得結果見圖2。萃取溫度45 ℃、萃取時間2.5 h、夾帶劑流速2.5 mL/min、萃取壓強25 MPa為各單因素的最大響應值。在正交試驗及響應曲面法試驗中以此為基礎，設計因素水平，進行提取工藝的優化。

2.2 正交試驗結果

由表4可以看出，對總黃酮得率影響的大小順序為C>A>D>B，即萃取時間>萃取壓強>夾帶劑無水乙醇流速>萃取溫度。其中萃取時間對總黃酮得率的影響最大，其次是萃取壓強，并且萃取的最優化組合為A2B1C3D2，即最優工藝為萃取壓強25 MPa，萃取溫度40 ℃，萃取時間3.0 h，夾帶劑無水乙醇流速2.5 mL/min，在此條件下進行驗證試驗，黃酮得率為（6.18±0.05）%。

2.3 響應曲面試驗結果

2.3.1 黃酮得率條件擬合 根據前期試驗分析，選取萃取時間、萃取壓強、夾帶劑無水乙醇流速、萃取溫度這4個因素，運用Design-Expert 8.0.6.0 軟件設計3個水平因子試驗，篩選顯著因素；通過爬坡試驗逼近最大響應區；然后運用Design-Expert 8.0.6.0軟件設計中心組合試驗，建立提取模型，預測最佳提取條件和黃酮得率。因素編碼及水平見表3。

由表6可知，萃取壓強、萃取時間對黃酮得率影響極顯著（P<0.01），萃取溫度對黃酮得率影響顯著（P萃取壓強>萃取溫度>夾帶劑無水乙醇流速。

2.3.2 擬合模型的建立 從圖3-a、圖3-b可知，試驗模型的各殘差分布結果基本都表明，經方法分析對總黃酮得率建立的試驗模型基本在同一條直線上，與失擬分析相一致。從模型分析顯著性可以看出，該試驗模型各殘差點在“0”點直線兩側不均勻分布，證明這2個模型的建立具有可靠性。失擬項P=0.427 3>0.05，不顯著，純誤差值為0.000 45，數值比較小。相關數據分析表明，該試驗模型的擬合程度較好，試驗誤差較小。失擬項反映擬合函數與離散點之間的關系，分析其結果值，極不明顯，對分析本模型具有重要作用。

模型方程回歸系數及顯著性檢驗結果見表6。可以看出，模型一次項A、B、C顯著或極顯著，D不顯著；二次項AC、A2、C2、D2顯著或極顯著；其余各項不顯著。因此可知，各個具體試驗因素與響應值都不是線性關系。

通過軟件對試驗模型進行分析，并且采用Y作為因變量，采用R1為總黃酮提取量，A、B、C、D分別代表萃取壓強、萃取溫度、萃取時間、夾帶劑流速。得到回歸方程如下：

R1=5.95+0.068×A+0.024×B+0.14×C+5.833×10-3×D+0.020×A×B-0.042×A×C-0.020×A×D+0.000×B×C+0.018×B×D+0.010×C×D-0.059×A2+

6.250×10-3×B2+0.076×C2-0.059×D2。

2.3.3 響應曲面結果分析 通過模型方程所作的響應曲面及等高線結果見圖4至圖9，萃取時間對總黃酮得率的影響最明顯，其次是萃取壓強，并且各個因素之間的交互作用并不明顯。根據圖4至圖9及表5、表6中的試驗結果分析，采用CO2超臨界技術萃取桑葉中的黃酮類物質，萃取時間和萃取壓強是需要考慮的重要因素[9，11-13]，提高萃取時間和萃取壓強雖然有利于活性物質從植物細胞中釋放出來，但是超過最適值之后，則有可能導致一些壓敏、熱敏感的黃酮物質在提取過程中發生分解或異構化反應[13]。目前已經有研究表明，在高溫高壓條件下總黃酮中部分物質的異構化進程大大加快[14]。萃取時間也是影響黃酮提取率的一個重要因素，在一定的萃取溫度、萃取壓強下，試驗總黃酮提取率隨著萃取時間的延長而提高，但延長萃取時間會增加夾帶劑的消耗，同時儀器損耗增加，故設定萃取時間需要綜合考慮，以獲得更好的經濟效應。相比其他參數而言，夾帶劑流速對總黃酮得率影響最不顯著（P=0.578 2），故在實際生產中，可以適當降低夾帶劑流速，降低生產成本。

2.3.4 最優提取條件的選擇 根據Design-Expert8.0.5軟件可以優化最佳方案，最佳提取率方案為壓強26.75 MPa，溫度50 ℃，時間3 h，流速2.61 mL/min，預期的總黃酮得率為6.20%。根據試驗結果，進行3組平行試驗，得到總黃酮得率為（6.21±0.05）%，試驗結果與Design-Expert8.0.5軟件優化的理論預測值比較誤差約為2.00%，可以證明采用響應曲面法優化得到的提取條件參數基本準確可靠，具有一定的實用價值。

2.4 響應曲面分析與正交試驗驗證比較

響應曲面法、正交試驗法優化工藝后所得的黃酮萃取率分別是（6.21±0.05）%、（6.18±0.05）%，可以看出響應曲

面法優化所得條件的黃酮萃取率大于正交試驗法，但是不顯著。正交試驗只能得到總黃酮萃取中各因素不同水平之間的最優組合，不能考察到組合外的情況，信息量少，而且未能體現各因素對總黃酮得率是否有顯著性影響。而響應曲面法對數據的分析比較詳細，不僅可以知道各因素對黃酮得率的影響大小，而且可以知道各因素是否對黃酮得率有顯著性影響。因此，響應曲面法與正交試驗法相比，在各因素對黃酮得率影響程度及顯著性的分析上優于正交試驗。endprint

3 結論與討論

傳統上萃取桑葉中總黃酮的方法主要有回流提取法、超聲提取法、微波提取法、索氏提取法等。但上述方法存在溫度相對較高、總黃酮提取率相對較低、萃余物質存在大量的溶劑殘余等缺陷。相比而言，超臨界CO2萃取方法能夠在較低溫度條件下實現桑葉中總黃酮物質的高效提取，萃取液中能夠保留多種具有生理活性的總黃酮成分，萃余物無有機溶劑殘留，流程簡單，操作相對簡單，可保護桑葉總黃酮中熱敏性物質不受破壞等特點，能夠很好地解決上述工藝缺陷[14-16]。

響應曲面法與正交試驗法都是優化有效成分提取工藝的最常用方法。正交試驗只能找到各因素不同水平之間的最優組合，不能考察不同水平組合之外的情況；而響應曲面法通過構建二次回歸模型，能找出試驗設置水平之外的最佳水平組合，還可以得到各因素對總黃酮得率的影響大小及顯著性。根據響應曲面法對提取影響因素的分析，確定最優工藝為萃取壓強 26.75 MPa，萃取溫度50 ℃，萃取時間3 h，夾帶劑流速2.61 mL/min，總黃酮預期提取率可達6.20%，驗證試驗的總黃酮得率是（6.21±0.05）%。可見響應曲面法對桑葉的提取工藝進行優化，不僅科學合理、準確可靠，而且快速可行，該方法對工藝方面的研究具有一定的意義。

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