Beclin1和HLAⅠ、Ⅱ在人卵巢癌SKOV3細胞中的表達及其關系

紀曉坤，王學利，王 珩，趙銀環，吳家寧，王 蕊，吳 娟，杜 蕓

Beclin1和HLAⅠ、Ⅱ在人卵巢癌SKOV3細胞中的表達及其關系

紀曉坤，王學利，王 珩，趙銀環，吳家寧，王 蕊，吳 娟，杜 蕓

目的探討轉染Beclin1質粒的自噬基因Beclin1和免疫應答效應分子HLAⅠ、Ⅱ在人卵巢癌SKOV3細胞中的表達，分析Beclin1在卵巢癌免疫應答中的作用。方法應用基因轉染技術、RT-PCR、Western blot法檢測Beclin1質粒轉染SKOV3細胞前后Beclin1和HLAⅠ、Ⅱ的mRNA和蛋白表達水平的變化。應用免疫熒光顯微鏡觀察Beclin1質粒轉染SKOV3細胞后，其自噬小體的變化。用MTT法檢測Beclin1質粒轉染SKOV3前后細胞的增殖活性。結果SKOV3細胞轉染Beclin1質粒后，Beclin1的轉錄和翻譯水平分別是空載體組的5、2倍。熒光顯微鏡觀察，轉染Beclin1質粒組卵巢癌細胞MDC標記的自噬小體數量顯著增多。RT-PCR和Western blot結果顯示，轉染Beclin1可誘導HLAⅠ、Ⅱ等位基因的轉錄和翻譯。Beclin1質粒組的HLAⅠ-A、B、C和HLAⅡ-DP、DQ、DR的mRNA分別是空載體組的2、1.6、3倍和2、6、3倍；其HLAⅠ、Ⅱ的蛋白表達分別是空載體組的2、1.6倍。MTT結果顯示，Beclin1質粒組與空載體組、空白對照組相比，在轉染24、48、72、96 h后，其細胞生長抑制率分別為42.6%、37.8%、24.35%、14.81%。結論在人卵巢癌SKOV3細胞中，轉染外源性Beclin1可誘導細胞自噬并使免疫應答效應分子HLAⅠ、Ⅱ的表達增加。HLAⅠ、Ⅱ表達的增加可能使卵巢癌細胞免疫應答增強。轉染外源性Beclin1可抑制卵巢癌SKOV3的細胞增殖。

卵巢腫瘤；Beclin1；HLAⅠ、Ⅱ；自噬；免疫應答

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中發病率和病死率最高的惡性腫瘤。盡管手術和化療不斷發展，卵巢癌的預后仍然較差，約15%的患者于診斷后1年內死亡，5年生存率僅25%[1]，其最主要原因是卵巢癌發現時已屬進展期(Ⅲ～Ⅳ期)。盡管考慮腫瘤分級、組織學類型和化療敏感性等普遍因素，卵巢癌的預后仍然存在較大差異，其主要來自于腫瘤和患者的差異，患者的差異主要體現在對卵巢癌的免疫應答。

接受日期：2017-07-05

目前，已有多項研究證實免疫應答在調節疾病過程中起顯著作用[2-3]。

在先天性和后天性腫瘤免疫應答中起關鍵性作用的人類主要組織相容性復合體HLAⅠ、Ⅱ，其在腫瘤性損傷中的表達會發生改變。據文獻報道[4]HLAⅠ、Ⅱ表達的改變在腫瘤免疫逃逸機制中發揮重要作用。近年更多的免疫學家和臨床腫瘤醫師將注意力轉向腫瘤細胞的經典和非經典HLAⅠ、Ⅱ表達的改變[5-8]。

自噬形態學上的特征性變化是細胞內出現大量自噬小體，而自噬在腫瘤的發生、發展和預后中的作用十分復雜。腫瘤細胞自噬增強可使其產生耐藥、抵抗放療并適應缺氧和營養缺乏狀態而存活。自噬異常增強可使細胞發生程序性死亡。近年，研究認為自噬的異常調節對卵巢癌的發病機制和耐受放、化療發揮重要作用[9]。目前，自噬與免疫應答間的關系尚未見報道，本實驗旨在探索兩者間的關系及其可能的相互作用。

1 材料與方法

1.1細胞株、培養條件及試劑SKOV3細胞株由河北醫科大學第四醫院科研中心提供，在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，于37 ℃、5%CO2環境下培養，當細胞達80%～90%融合時用0.25%胰蛋白酶-EDTA液進行消化以1 ∶4傳代，次日換液，每2天傳代1次。

1.2方法將SKOV3細胞按每毫升5×105個的密度接種于不含抗生素的RPMI 1640培養基的無菌6孔培養板內，待細胞生長密度達80%～90%時，按轉染試劑盒提供的方法進行轉染。實驗分3組，分別為轉染外源性Beclin1質粒組、空載體組、空白對照組。

1.3轉染法取OPTI-DMEM 100 μL，加入Lipofectamine 2000DNA轉染試劑2 μL，輕輕混勻，室溫靜置孵育5 min；向上述混合液中加入0.5 μg/μL的質粒DNA 1 μL，輕輕混勻，室溫孵育20 min；先在每孔細胞中加入1.5 mL不含牛血清、不含抗生素的RPMI 1640培養基，再將上述混合物分別加入各孔細胞中，輕輕混勻；轉染6 h后更換含10%胎牛血清的完全培養基，繼續培養至48 h收集細胞，提取細胞總RNA和總蛋白，進行RT-PCR和Western blot實驗。

1.4RNA提取和RT-PCR實驗采用Trizol法提取細胞中總RNA，紫外分光光度計測其濃度，用Fermentas公司的反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，用美國ABI公司的7500實時定量PCR儀，以合成的cDNA為模板，以美國Promega公司的GoTaq qPCR Master Mix實時定量試劑盒為反應體系，進行目的基因擴增。

1.5細胞總蛋白提取和Westernblot實驗細胞轉染72 h后，加入細胞裂解液及蛋白酶抑制劑(兩者體積比為100 ∶1)提取細胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，定量后的蛋白用于Western blot實驗。

Western blot實驗：制備5%濃縮膠和12%分離膠，根據蛋白濃度以每孔100 μg上樣；SDS-PAGE電泳：5%濃縮膠90 V 40 mA條件電泳到達分離界面后，改換電壓120 V 40 mA，1.5～2 h分離樣品蛋白；根據蛋白Marker在目的條帶區域的凝膠處切膠，置于轉膜緩沖液中浸泡，PVDF膜先放入甲醇液中激活3 min，再放入轉膜緩沖液中平衡10 min；由負極到正級依次為：3層濾紙、凝膠、PVDF膜、3層濾紙，放入電轉儀中，4 ℃條件下進行印跡電泳(恒流180 mA、120 min)，將凝膠中的蛋白質轉移到PVDF膜上；將PVDF膜用5%脫脂奶粉37 ℃震蕩封閉1 h；TTBS洗膜3次，加入Beclin1和GAPDH一抗(稀釋比例均為1 ∶1 000)，HLA Ⅰ和HLA Ⅱ一抗(稀釋比例均為1 ∶100)，4 ℃孵育過夜(>6 h)；TTBS洗膜3次，加入抗兔熒光二抗(稀釋比例為1 ∶5 000)，37 ℃避光孵育1 h；TTBS避光洗膜3次，最后用Odyssey成像系統檢測結果，采集灰度值，保存圖片。

1.6MTT比色法測定細胞增殖收集瞬時轉染后對數生長期的3組細胞，以每孔每毫升1×104個細胞分別接種于96孔板，每組設10個復孔，置于37 ℃、5%CO2條件下進行培養。分別在轉染后第24、48、72、96 h每孔加入濃度為5 mg/mL的四甲基偶氮唑藍(MTT)20 μL，溫箱培育4 h后小心吸取培養基，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩混勻10 min，酶標儀測定492 nm處的吸光度(A)值以計算SKOV3細胞的生長抑制率：抑制率(%)=(1-A轉染組/A未轉染組)×100%。

1.7MDC染色檢測自噬小體取對數生長期SKOV3細胞以每孔每毫升1×106個細胞密度接種于放有蓋玻片的6孔板中，待細胞貼壁后按外源性Beclin1組、空載體組和空白對照組進行瞬時轉染，在轉染48 h后，PBS洗2次，換含MDC(0.05 mmol/L)的新鮮培養基于37 ℃培養箱避光孵育60 min后，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗2次，取出細胞爬片，晾干后在熒光顯微鏡下觀察和照相。

2 結果

2.1SKOV3細胞轉染Beclin1質粒后Beclin1的表達SKOV3細胞轉染Beclin1質粒后，其自噬相關基因Beclin1的轉錄和翻譯水平分別是轉染空載體質粒組的5、2倍。轉染Beclin1質粒后，各組Beclin1 mRNA表達分別為：轉染Beclin1質粒組9.29±0.27、空載體組1.84±0.10、空白對照組1.39±0.01，其數據分析采用單因素方差分析SNK兩兩比較和非參數檢驗進行分析，轉染Beclin1質粒組與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。Beclin1蛋白表達分別為：轉染Beclin1質粒組11.68±2.90、空載體組5.13±0.61、空白對照組5.67±0.85，其數據采用單因素方差分析SNK兩兩比較，轉染Beclin1質粒組與空載體組、空白對照組比較差異均有統計學意義(P<0.01，圖1)。

圖1Westernblot法檢測SKOV3卵巢癌細胞Beclin1的蛋白表達

1.轉染外源性Beclin1質粒組；2.空載體組；3.空白對照組

2.2轉染Beclin1質粒后SKOV3細胞自噬小體的變化轉染Beclin1質粒組卵巢癌細胞MDC標記的自噬小體數量顯著增多，提示轉染外源性Beclin1可誘導卵巢癌SKOV3細胞自噬增強(圖2)。

ABC圖2 熒光顯微鏡觀察轉染48h后SKOV3細胞中自噬小體的變化：A．轉染外源性Beclin1質粒組；B．空載體組；C．空白對照組

2.3轉染Beclin1質粒后HLAⅠ、Ⅱ的表達轉染外源性Beclin1可誘導HLAⅠ、Ⅱ等位基因即HLAⅠ-A、B、C 和 HLAⅡ-DP、DQ、DR的轉錄和翻譯。Beclin1質粒組的HLAⅠ-A、B、C和HLAⅡ-DP、DQ、DR的轉錄mRNA(表1)分別是空載體組的2、1.6、3倍和2、6、3倍；其HLAⅠ、Ⅱ的蛋白表達分別是空載體組2、1.6倍(表2，圖3)。

表1 RT-PCR檢測SKOV3卵巢癌細胞等位基因HLAⅠ-A、B、C和HLAⅡ-DP、DQ、DR的mRNA表達

與空白對照組相比，aP<0.01；與空白對照組，bP<0.05

表2 Western blot法檢測SKOV3卵巢癌細胞HLA Ⅰ、Ⅱ的蛋白表達

與空載體組、空白對照組相比，aP<0.01

圖3Westernblot法檢測SKOV3細胞HLAⅠ、Ⅱ的蛋白表達

1.轉染外源性Beclin1質粒組；2.空載體組；3.空白對照組

2.4轉染Beclin1質粒后SKOV3細胞的生長抑制率轉染Beclin1質粒組與空載體組、空白對照組相比，在轉染24、48、96 h后，其細胞生長抑制率分別為42.6%、37.8%、24.35%、14.81%(表3)。

表3 MTT比色法測定SKOV3卵巢癌細胞的增殖

與空白對照組相比，aP<0.01

3 討論

免疫系統能識別并清除腫瘤細胞，以阻止腫瘤的生長和擴散。近年，對腫瘤免疫監視理論的研究突出免疫逃逸機制在腫瘤發生、發展及預后中作用。HLAⅠ、Ⅱ表達的改變在已發現的腫瘤細胞逃避免疫識別及清除機制中發揮重要作用，越來越多的免疫學家及臨床腫瘤醫師在研究腫瘤免疫逃逸機制中更青睞于分析HLAⅠ、Ⅱ表達改變。在一些腫瘤中[4,10-11]，HLAⅠ、Ⅱ的表達與臨床預后的關系能反映兩者在腫瘤細胞先天性和獲得性免疫系統的相互作用中發揮作用。值得注意的是，在大量腫瘤性損傷中已經發現HLAⅠ、Ⅱ的表達改變[4,10]。

Chang等[10]報道除肝癌、白血病及淋巴瘤外的大部分腫瘤中均存在HLAⅠ表達異常，對100多種腫瘤性損傷的研究發現16%～80%的損傷出現HLAⅠ的表達缺失或下降[4]。在非經典型HLAⅠ的抗原中，HLA-G已證實在卵巢癌中表達[10-13]。HLAⅡ抗原不同于HLAⅠ，其通常在惡性腫瘤細胞中高表達[14-15]，頻率為0～100%。

前期研究顯示HLAⅠ在識別并清除腫瘤細胞中發揮重要作用，該作用具有HLAⅠ依賴性，由此可見腫瘤細胞HLAⅠ表達異常使機體免疫系統對腫瘤細胞的免疫應答產生不利影響。作為非經典型HLAⅠ抗原的代表HLA-G，其作用可抑制細胞毒細胞的活性和CTL、CD4+輔助T細胞的增殖，抵抗NK細胞介導的腫瘤殺傷作用[4]；HLA-G也可將APC(抗原提呈細胞)細胞膜上的HLA-G轉移至活化T細胞，誘導產生新的輔助T細胞亞群。該作用為腫瘤細胞逃避免疫識別和清除提供幫助[16]。值得注意的是NK細胞的腫瘤殺傷作用是由經典型和非經典型HLAⅠ與NK細胞配體激活共同作用的結果。HLAⅡ分子可將抗原肽提呈給輔助T細胞，而HLAⅡ在抗原肽提呈過程中需要HLAⅠ、APM及共刺激分子協同作用[4]。通常CD4+T與HLAⅡ-抗原肽復合物及APC細胞的共刺激分子相互作用，通過CD40-CD40L的作用導致CD8+T細胞和活化的APC細胞的增殖和分化，從而提高抗原提呈作用。HLAⅡ依賴性和腫瘤抗原特異性CD4+T可間接地通過釋放IFN的細胞因子活化嗜酸性粒細胞、巨噬細胞及中性粒細胞，殺滅腫瘤細胞[6]。

自噬是細胞吞噬細胞質和細胞器于雙層膜結構的自噬小體中，并將自噬小體運送至溶酶體將其降解為氨基酸和能量再利用的動態連續過程?；A水平的自噬有助于通過清除受損傷及衰老的細胞器和更新長壽蛋白維持內環境穩態；而持續大量的自噬可導致細胞程序性死亡[17]。然而，自噬在腫瘤中起截然相反的兩種作用：一方面自噬阻止腫瘤形成；另一方面使腫瘤細胞在營養缺乏、代謝性應激、抵抗化療藥物等不利環境中生存。自噬調節異常可能在卵巢癌的發病機制及抵抗放、化療的治療中發揮重要作用[9]。Beclin1是第一個被發現的自噬相關基因，也是自噬最重要的效應分子和腫瘤抑制因子，參與自噬的起始、自噬小體的形成和降解等過程。Beclin1在40%～75%的人類散發性乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中存在單等位基因缺失[18]。在Liang等[19]的研究中顯示50%散發性卵巢癌中發現Beclin1單等位基因缺失，與卵巢良性腫瘤相比Beclin1在卵巢癌中的表達下調。在體外研究和體內異種移植腫瘤研究中已證實，在乳腺癌MCF-7中Beclin1的異位表達完全可以使乳腺癌MCF-7重建自噬[19]。Peracchio等[9]未公開的數據顯示在卵巢癌患者中提高Beclin1和 LC3表達能提高化療的有效率，該現象有助于探索癌癥治療的新方法。

本實驗著重分析提高細胞自噬能否提高卵巢癌的免疫應答，實驗顯示在卵巢癌SKOV3細胞中提高Beclin1表達能誘導自噬而抑制細胞增殖，同時可以誘導免疫應答效應分子HLAⅠ、Ⅱ的表達。此結果為揭示腫瘤中自噬與免疫系統間未知的關系提供實驗數據。

目前，卵巢癌的免疫生物治療方法取得重大突破。在諸如惡性黑色素瘤和腎細胞癌中免疫生物治療取得巨大成功；而相似的治療方針已延伸到卵巢癌的治療中。但是在卵巢癌取得巨大進展的標準治療中仍然缺乏重要的腫瘤免疫學知識。另外，在惡性腫瘤中HLAⅠ的表達缺失有助于腫瘤細胞逃避CTL細胞的識別和清除，因此其有望成為潛在性有益的T細胞免疫治療新方法。本實驗顯示在卵巢癌SKOV3細胞中提高Beclin1表達可誘導自噬進而提高HLAⅠ、Ⅱ的表達并抑制細胞增殖，為卵巢癌患者提高免疫反應增加抗腫瘤作用改善預后提供實驗依據。

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ExpressionofBeclin1andHLAⅠ, ⅡinhumanSKOV3ovariancancercellsandtheircorrelation

JI Xiao-kun, WANG Xue-li, WANG Heng, ZHAO Yin-huan, WU Jia-ning, WANG Rui, WU Juan, DU Yun

(DepartmentofCancerDetection,theForthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

PurposeThe aim of this study was to investigate the relationship between autophagy gene Beclin1 and immune response effector classical HLAⅠ, Ⅱ in SKOV3 cells. To explore the role of Beclin1 in immunity in ovarian cancer cells which were transfected with the vector of Beclin1.MethodsRT-PCR and Western blot were used to detect the expression of Beclin1 and HLAⅠ, Ⅱ in SKOV3 cells. Fluorescence microscope was carried out to observe the unique autophagosome in SKOV3 cells. MTT was used to analyze the proliferation of the Beclin1 over-expressed SKOV3 cells.ResultsTransfection SKOV3 cells with Beclin1 vector could induce Beclin1 transcription and translation approximately 5 and 2 times compared with empty vector group respectively. The autophagosome stained by MDC was observed by fluorescence microscope. And much more green fluorescence signal was observed in Beclin1 vector group. RT-PCR and Western blot indicated that HLAⅠ, Ⅱinduced by transfection with extrinsic Beclin1. The allelic transcriptions of HLAⅠ-A, B, C and HLAⅡ-DP, DQ, DR in extrinsic Beclin1 group were approximately 2, 1.6, 3 and 2, 6, 3 times compared with empty vetcor group or untreated group, respectively. The results of Western blot showed that HLAⅠ, Ⅱin Beclin1 vector group induced as much as 2 and 1.6 times compared with empty vetcor group or untreated group, respectively. The results of MTT showed that the proliferation of SKOV3 cells treated with Beclin1 vector was significantly suppressed. The percentage of suppression in Beclin1 vector group at 24 h, 48 h, 72 h and 96 h is 42.6%, 37.8%, 24.35%, 14.81% compared with untreated group or empty vector group respectively.ConclusionThe enhancement of autophagy by over-expression of Beclin1 could induce HLAⅠ, Ⅱ transcription and translation in SKOV3 cells. The expression of HLAⅠ, Ⅱmay be responsible for triggering the immune response in ovarian cancer. Over-expression of Beclin1 could inhibit the proliferation of SKOV3 cells which were transfected with extrinsic Beclin1.

ovarian neoplasm； Beclin1； HLAⅠandⅡ； autophagy； immune response

R 737.31

A

1001-7399(2017)09-0954-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.09.003

河北醫科大學第四醫院癌檢中心，石家莊 050011

紀曉坤，女，碩士，醫師。E-mail: jixiaokun01@163.com

杜 蕓，女，博士，主任醫師，通訊作者。E-mail: yydd40@126.com