子宮頸癌中SIX1的表達及其與細胞增殖的關(guān)系

黃江梅，肖 芳，陳艷昕，李 桃，周 穎，趙 敏，張 輝

子宮頸癌中SIX1的表達及其與細胞增殖的關(guān)系

黃江梅，肖 芳，陳艷昕，李 桃，周 穎，趙 敏，張 輝

目的探討SIX1在子宮頸癌組織中的表達以及生物學(xué)作用。方法采用免疫組化EliVision兩步法檢測35例子宮頸癌、42例子宮頸上皮內(nèi)病變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)及15例正常子宮頸組織中SIX1的表達及Ki-67增殖指數(shù)。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，采用SIX1-siRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染子宮頸癌Hela細胞，檢測轉(zhuǎn)染后子宮頸癌Hela細胞SIX1的mRNA和蛋白表達水平；應(yīng)用MTT檢測Hela細胞的增殖能力。結(jié)果子宮頸癌組織中SIX1陽性率高于CIN組織及正常子宮頸組織(P<0.05)，且與Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05)。RT-PCR和Western blot檢測顯示轉(zhuǎn)染SIX1-siRNA子宮頸癌Hela細胞中SIX1在mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)；Hela細胞生長速度減慢。結(jié)論SIX1可能通過促進子宮頸癌細胞的增殖，在子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

子宮頸腫瘤；子宮頸上皮內(nèi)病變；SIX1；Ki-67

子宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅身體健康[1]。同源盒基因是一類能夠特異性調(diào)節(jié)基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在細胞生長、增殖、遷移等過程中發(fā)揮重要作用，SIX1基因是新近發(fā)現(xiàn)的同源盒基因，在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。近年研究顯示SIX1在多種惡性腫瘤中呈高表達[3]，但在子宮頸癌中表達的報道較少。本文檢測SIX1在子宮頸癌中的表達及對子宮頸癌細胞增殖的影響，探討SIX1在子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1材料收集2015年10月～2016年10月秦皇島市第一醫(yī)院經(jīng)病理確診的子宮頸癌35例，子宮頸上皮內(nèi)病變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)42例和正常子宮頸15例，所有患者術(shù)前均未行放、化療。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購自Takara公司，SIX1-siRNA質(zhì)粒載體購自上海吉瑪公司，SIX1(C104244，工作濃度1 ∶150)抗體購自SIGMA公司，Ki-67抗體及DAB試劑盒購自福州邁新公司。子宮頸癌Hela購自北京協(xié)和細胞資源中心，在含10%胎牛血清的DMEM(NEAA)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2免疫組化

1.2.1免疫組化檢測 采用免疫組化EliVision兩步法染色，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。切片常規(guī)脫蠟至水，EDTA(pH 8.0)抗原修復(fù)液高壓修復(fù)1.5 min，0.3%雙氧水封閉10 min，一抗4 ℃過夜，用PBS代替一抗做陰性對照，二抗室溫30 min，DAB顯色后蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。

1.2.2免疫組化判斷標準 SIX1陽性染色呈棕黃色顆粒，主要定位于細胞核，陽性細胞≥10%為陽性；Ki-67以細胞核呈棕黃色染色為陽性，高倍鏡下計數(shù)100個腫瘤細胞中陽性細胞數(shù)所占的百分比，隨機計數(shù)5個高倍鏡視野，以平均數(shù)作為細胞增殖指數(shù)。在正常子宮頸組織和CIN組織中，SIX1及Ki-67陽性表達主要定位于基底層以上鱗狀上皮細胞，僅局限于基底層細胞著色則判為陰性。

1.3SIX1-siRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞在GenBank中檢索SIX1的全長序列，針對目的基因SIX1設(shè)置4個靶點，構(gòu)建4套SIX1-siRNA重組質(zhì)粒，分別標記為SIX1-siRNAa、SIX1-siRNAb、SIX1-siRNAc、SIX1-siRNAd以及非特異對照質(zhì)粒(contral-siRNA)，其含有一段與目的基因序列無同源性的siRNA。細胞轉(zhuǎn)染采用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。實驗分為5組：實驗組a、b、c、d和非特異性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，siRNA的最佳轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L，常規(guī)轉(zhuǎn)染后48 h提取細胞總RNA，轉(zhuǎn)染后72 h提取細胞總蛋白，用RT-PCR和Western blot分別進行檢測。

1.4RT-PCR檢測Hela細胞中SIX1的mRNA表達用Trizol試劑提取細胞的總RNA，具體操作步驟按試劑盒說明書進行，以等量RNA作為起始模板，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。按SYBR Green PCR試劑盒在定量PCR儀上進行RT-PCR檢測，反應(yīng)體系94 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。

1.5Westernblot檢測Hela細胞中SIX1蛋白的表達提取4個實驗組和非特異性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的蛋白，BCA法蛋白定量試劑盒定量，每孔加樣50 μg蛋白，按《分子克隆實驗指南》操作，以10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，電泳完成后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫下孵育封閉1 h，1 ∶100稀釋一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗去一抗，加入HRP標記的二抗，在室溫下孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL試劑盒顯影，以β-actin作為內(nèi)參。

1.6MTT檢測子宮頸癌細胞增殖能力采用MTT法將轉(zhuǎn)染后的轉(zhuǎn)染組和對照組細胞分別接種于3塊96孔板，接種密度為每孔5×103個細胞，分別于1、3、5天取1板進行MTT反應(yīng)，測定490 nm吸光度值，比較轉(zhuǎn)染組細胞與對照組細胞的生長增殖情況。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法兩組定量數(shù)據(jù)的比較采用獨立樣本t檢驗；三組符合正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析法，三組之間兩兩比較采用SNK-q檢驗法，兩組定性數(shù)據(jù)的比較采用χ2檢驗；三組定性數(shù)據(jù)的比較采用χ2檢驗，三組之間兩兩比較采用P值修正法，即P=0.016 7為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SIX1蛋白表達與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系子宮頸癌組織中SIX1呈彌漫性分布，并突破基底層，陽性率為68.5%，在CIN組織其散在分布于上皮層中，陽性率為11.9%，在正常子宮上皮組織中SIX1不表達，僅在基底層細胞中有個別表達。子宮頸癌組SIX1陽性率高于CIN組及正常子宮頸組(P<0.01)。CIN組與正常子宮頸組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；且SIX1在子宮頸癌組織中的表達與患者年齡無關(guān)(P>0.05)；與腫瘤分化程度、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05，表1，圖1～3)。

2.2Ki-67表達與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系子宮頸癌組織中Ki-67增殖指數(shù)為(53.2±9.28)%，CIN組織中Ki-67增殖指數(shù)為(5.4±1.14)%，正常子宮上皮組織中Ki-67增殖指數(shù)為0。

表1 SIX1表達與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

①②③圖1 SIX1在正常子宮頸組織中的表達，EliVision兩步法圖2 SIX1在CIN組織中的表達，EliVision兩步法圖3 SIX1在子宮頸癌組織中的表達，EliVision兩步法

子宮頸癌組中Ki-67的增殖指數(shù)高于CIN組及正常子宮頸上皮組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，CIN組與正常子宮頸組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3SIX1和Ki-67表達的相關(guān)性Spearman等級相關(guān)分析顯示：在子宮頸各組織中SIX1和Ki-67的表達呈正相關(guān)(表2)。

2.4RT-PCR測定SIX1mRNA水平計算方法如下：ΔCt=Ct(SIX1)-Ct(β-actin) ；ΔΔCt=ΔCt(SIX1-siRNA)-ΔCt (control-siRNA) ；抑制率=( 1-2-ΔΔCt) ×100%。RT-PCR的實驗表明，轉(zhuǎn)染SIX1-siRNA表達質(zhì)粒能夠有效下調(diào)子宮頸癌細胞的mRNA水平，4個實驗組中SIX1基因在轉(zhuǎn)錄水平被不同程度抑制，其中SIX1-siRNAc對SIX1基因的抑制效果最佳，沉默效果最好(表3)。

表2 SIX1和Ki-67在子宮頸各組織中的表達

表3 轉(zhuǎn)染48 h后Hela細胞中SIX1 mRNA的表達

2.5Westernblot法檢測SIX1-siRNA表達質(zhì)粒對Hela細胞SIX1蛋白表達的影響Western blot實驗結(jié)果顯示，SIX1-siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(SIX1-siRNA/Hela)的SIX1蛋白表達水平均低于control-siRNA/Hela。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，4個實驗組Hela細胞中SIX1蛋白表達較陰性對照組均有一定程度的降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。4個實驗組SIX1蛋白表達量各不相同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)；其中實驗組SIX1-siRNAc的蛋白表達量低于其他實驗組(表4，圖4)。

圖4 SIX1蛋白在各組Hela細胞中的表達

表4 轉(zhuǎn)染72 h后Hela細胞中SIX1蛋白表達(n=5)

與control-siRNA相比，#P<0.01

2.6MTT法檢測細胞的生長與增殖由MTT法檢測細胞吸光度值，結(jié)果顯示第1、3、5天轉(zhuǎn)染細胞的OD值與對照組比較，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，表5)。

3 討論

同源盒基因是一類特殊的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠特異性調(diào)控基因表達，SIX1是同源盒基因家族的重要成員，近年研究表明SIX1在細胞的增殖、分化、凋亡及細胞形態(tài)、細胞黏附和遷移中均發(fā)揮關(guān)鍵作用[4-6]，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中能誘導(dǎo)癌細胞的增殖和侵襲[7]，是重要的癌基因。

SIX1基因定位在人染色體14q23上，其產(chǎn)物SIX1蛋白是由1個高度保守的同源異型結(jié)構(gòu)域(homeodomain，61個氨基酸)的N-末端和SIX結(jié)構(gòu)域(SIXdomain，110～115個氨基酸)組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，該復(fù)合結(jié)構(gòu)通過與DNA 特定結(jié)合調(diào)控下游基因的表達，在細胞增殖和組織發(fā)育中起關(guān)鍵作用[8]。以往研究顯示SIX1是E2F1的轉(zhuǎn)錄靶基因，其轉(zhuǎn)錄活性一般維持在G1/S期到有絲分裂早期，在有絲分裂的后期由蛋白水解降解。因此，SIX1可作為細胞周期調(diào)節(jié)器，活化細胞周期調(diào)節(jié)因子，促進細胞分化、增殖；SIX1的過表達則削弱該作用，相反其加速細胞周期進程，造成細胞無限增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

近年研究表明，SIX1在多種惡性腫瘤中過表達，Coletta等[9]發(fā)現(xiàn)SIX1在早期和轉(zhuǎn)移性乳腺癌中過表達。SIX1在晚期卵巢癌的表達水平是早期卵巢癌的3倍[10]。SIX1在肝細胞癌患者的非腫瘤組織和正常人肝組織中不表達，而在肝細胞癌的腫瘤組織中SIX1 mRNA和蛋白過表達，且過表達與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)[11]。眾多研究顯示過表達SIX1表現(xiàn)促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。

腫瘤細胞增殖與腫瘤發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)，是反映腫瘤良惡性以及惡性程度的重要指標，惡性增殖是腫瘤的重要特征。因此評價細胞的增殖狀態(tài)，對分析腫瘤的生物學(xué)行為具有重要意義[12]。Ki-67作為細胞增殖的標志物，能有效反應(yīng)細胞增殖的活躍程度[13]。我們通過檢測SIX1和Ki-67在子宮頸癌及CIN和正常子宮頸組中的表達，發(fā)現(xiàn)SIX1在正常子宮頸黏膜上皮中幾乎不表達，僅在基底層細胞中有個別呈弱陽性，與王彤等[8]報道(陽性率15.6%)不一致，可能與本組樣本數(shù)較少及抗體的差異性有關(guān)。SIX1在CIN組中陽性細胞數(shù)增多，分布增廣；在子宮頸癌組織中的表達明顯增強，陽性細胞呈彌漫性分布，三者比較差異有顯著性。SIX1在子宮頸癌組織中的表達差異與腫瘤分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡無關(guān)(P>0.05)。Ki-67在正常子宮頸上皮不表達，但有1～2層基底層細胞表達，CIN組和子宮頸癌組上皮細胞增殖明顯，陽性率逐次增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。SIX1的表達和Ki-67增殖指數(shù)呈明顯正相關(guān)，SIX1表達在一定程度上較好的反映子宮頸上皮不同階段細胞增殖活性的變化。同時我們利用RNA干擾技術(shù)抑制子宮頸癌Hela細胞的SIX1基因表達，發(fā)現(xiàn)下調(diào)Hela細胞SIX1的mRNA和蛋白表達水平后，Hela細胞的增殖能力降低，進一步證實SIX1可能與子宮頸癌細胞增殖有關(guān)。SIX1的表達可能具有促進癌細胞增殖的作用，與子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有望成為子宮頸癌的重要分子標志物。

表5 轉(zhuǎn)染第1、3、5天 Hela細胞的增殖

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ExpressionofSIX1incervicalcancerandrelationshipwithcervicalcancercellproliferation

HUANG Jiang-mei, XIAO Fang, CHEN Yan-xin, LI Tao, ZHOU Ying, ZHAO Min, ZHANG Hui

(DepartmentofPathology,theFirstHospitalofQinhuangdao,Qinhuangdao066000,China)

PurposeTo investigate the expression of SIX1 in cervical cancer and its biological function.MethodsThe expression of SIX1 and Ki-67 in 35 cervical cancer tissues, 42 cervical intraepithelial neoplasia (CIN) tissues and 15 normal cervical tissues was detected by immunohistochemical of EliVision two-step staining. A plasmid vector expressing SIX1 siRNA was constructed and then stably transfected into Hela cells. The expression of SIX1 mRNA and protein was examined by RT-PCR and Western blot method respectively. The proliferation was examined by MTT.ResultsThe positive rate of SIX1 in cervical cancer was significantly higher than that of CIN and normal cervical tissues and was positively correlation with the proliferation index of Ki-67. After RNAi treatment, the mRNA and protein levels of SIX1 was down-regulated in Hela cells and the proliferation of Hela cells was inhibited.ConclusionSIX1 may play an important role in the occurrence and development process of cervical cancer by promoting cervical cancer cell proliferation.

cervical neoplasm；cervical intraepithelial neoplasia； SIX1； Ki-67

時間：2017-9-18 6:23 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170918.0623.004.html

R 737.33

A

1001-7399(2017)09-0959-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.09.004

接受日期：2017-07-24

秦皇島市第一醫(yī)院病理科 066000

黃江梅，女，碩士，副主任醫(yī)師。E-mail： 402281091@qq.com