miR-200a對肺癌A549細胞增殖、遷移及凋亡的影響

劉曙光，章思思，邵牧民，馬紅梅，申 洪

miR-200a對肺癌A549細胞增殖、遷移及凋亡的影響

劉曙光1，章思思2，邵牧民3，馬紅梅1，申 洪2

目的探討miR-200a在肺癌細胞中的表達及其對A549細胞增殖、遷移及凋亡等生物學功能的影響。方法采用RT-PCR檢測肺癌細胞株A549、H23、H460和永生化人支氣管上皮細胞株16HBE的表達水平。采用脂質體轉染法將miR-200a mimics和陰性對照序列(miR-negtive control, miR-NC)分別轉染A549細胞，運用CCK-8實驗和平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力的改變情況；Transwell實驗檢測細胞遷移能力；流式細胞術檢測細胞凋亡情況。利用生物信息學方法預測miR-200a的靶基因。結果miR-200a在肺癌細胞株A549、H23和H460相對表達水平均低于16HBE組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR-200a mimics和miR-NC組分別轉染A549細胞，CCK-8實驗顯示miR-200a mimics組在第4、5天時的OD值明顯低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；平板克隆形成實驗顯示miR-200a mimics組細胞克隆形成率為(33.13±0.74)%，明顯少于miR-NC組(45.57±1.27)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Transwell實驗顯示，miR-200a mimics穿膜細胞數為(71.60±17.90)個，少于miR-NC組[(140.20±17.88)個]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。流式細胞術檢測顯示，miR-200a mimics凋亡率為(17.80±1.90)%，明顯高于miR-NC組[(11.33±1.96)%]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。生物信息學方法預測Tiam1等可能是miR-200a的靶基因。結論miR-200a能夠抑制肺癌細胞A549的增殖、遷移并促進其凋亡，為肺癌的治療提供潛在靶點。miR-200a可能通過靶基因Tiam1發(fā)揮其對腫瘤的調控作用。

肺腫瘤；miR-200a；A549細胞；增殖；遷移；凋亡

肺癌是最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率和病死率均占全球首位，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占所有肺癌的80%。NSCLC發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟、多因素的過程，涉及眾多基因和蛋白。miRNA是一類非編碼微小RNA，廣泛存在于真核生物體內，在轉錄后水平調控基因的表達。近年研究發(fā)現，miR-200a與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關，通過其靶基因和多種信號轉導途徑發(fā)揮抑癌或促癌作用。目前，有關miR-200a在NSCLC中功能的研究鮮有報道。因此本實驗通過分析miR-200a對肺癌A549細胞生物學行為的影響，旨在為NSCLC的發(fā)病機制和治療策略提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1主要材料人NSCLC細胞株A549、H23、H460和永生化人支氣管上皮細胞株16HBE均來自南方醫(yī)科大學病理系重點實驗室。PRIM 1640、胎牛血清FBS及胰蛋白酶(HyClone公司)；逆轉錄試劑盒(Thermo公司)；轉染試劑盒(Invitrogen公司)；miR-200a mimics、隨機陰性對照RNA(上海吉瑪生物公司)；RT-PCR檢測試劑盒(全式金公司)；TRIzol(Takara公司)；CCK-8試劑盒(Dojindo公司)；Transwell小室(Corning公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與轉染 細胞選用PRIM 1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據細胞生長情況每2～3天換液培養(yǎng)1次，當細胞覆蓋瓶底壁大部分表面時，進行細胞傳代或收集細胞。將生長狀態(tài)穩(wěn)定的A549細胞[細胞數(4～5)×105個]接種于6孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后進行細胞轉染，轉染過程嚴格按照Lipofectamine RNAiMax說明書進行。轉染miR-200a mimics為實驗組，轉染miRNA negative control(miR-NC)作為陰性對照組，轉染后6 h更換新鮮培養(yǎng)液進行后續(xù)實驗。miR-200a mimics序列：5′-UAACACUGUCUGGUAACGAUGU-3′；3′-AUCGUU ACCAGACAGUGUUAUU-5′；miR-NC序列：5′-CAG UACUUUUGUGUAGUACAA-3′。

1.2.2RT-PCR檢測不同細胞株中miR-200a表達 采用RNA 抽提試劑盒抽提各細胞株中總RNA，逆轉錄引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACACATCGTT-3′。逆轉錄合成cDNA保存于-80 ℃冰箱中備用。定量PCR上游引物：5′-CATGACACTGTCTGGTAAC-3′；下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。PCR擴增反應體系為20 μL，其中包括miR-PCR primers 2 μL、2×SYBR Mix 10 μL、miRNA RTproduct 2.0 μL、Rox 0.1 μL、蒸餾水5.9 μL。以U6為內參，所測定的miR-200a的相對表達量采用2-ΔΔCt表示。

1.2.3CCK-8檢測A549細胞的增殖能力 具體操作參照CCK-8 試劑盒說明書進行。將轉染24 h的A549細胞以每孔(1～2)×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100 μL，設空白對照(僅加培養(yǎng)基)；分別培養(yǎng)1、2、3、4、5天。每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h后終止培養(yǎng)，以空白對照孔調零，酶標儀上450 nm 測定各孔吸光度值(OD值)，以相對應OD值表示細胞增殖能力的大小。各組取3 孔平均值，繪制增殖曲線，實驗重復3 次。

1.2.4平板克隆實驗 將轉染后的實驗組和陰性對照組細胞接種在6 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種細胞200個(每孔加培養(yǎng)液2 mL)，將培養(yǎng)板置于37 ℃、CO2體積分數為5% 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2周。密切觀察細胞的生長情況，2 周時出現肉眼可見的集落形成，即可終止培養(yǎng)。移除培養(yǎng)液，加入1 mL PBS洗滌細胞3次，再用4%的多聚甲醛固定10 min，然后用吉姆薩染色法染色20 min，置于空氣中干燥。計數細胞克隆。

1.2.5Transwell小室遷移實驗 采用24孔板，每孔加入600 μL RPMI 1640+10 %FBS培養(yǎng)基后放入Transwell小室。轉染24 h后將miR-200a mimics組、miR-NC組細胞以0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化，吹打成單細胞懸液，并以每孔200 μL 有1×104個細胞接種于Transwell小室上層，每組設置3個復孔，48 h后，用PBS洗滌細胞3次。4%多聚甲醛固定細胞30 min，用PBS洗滌細胞3次，蘇木精染色，30 min后，流水清洗培養(yǎng)板。計數，拍照，本實驗重復3次。

1.2.6流式細胞術檢測細胞的凋亡率 轉染48 h后消化收集細胞，制成單細胞懸液，經1 200 r/min 離心5 min，棄上清。預冷PBS洗滌細胞2次，用500 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL FITC標記的Annexin V，加入10 μL的PI。混勻后室溫避光孵育5 min，立即上流式細胞儀檢測。

1.4hsa-miR-200a靶基因預測miR-200a潛在靶基因應用miRWalk綜合數據庫(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)進行預測，并取其中Targetscan、miRanda、RNAhybrid、miRWalk和Microt4共5種工具計算基因交集。

2 結果

2.1miR-200a在肺癌細胞株和正常支氣管上皮細胞株中的表達RT-PCR檢測肺癌細胞株及永生化人支氣管上皮細胞株16HBE中miR-200a的表達，結果發(fā)現miR-200a在3種肺癌細胞株中的表達均明顯低于16HBE(P均<0.05)。其中以A549細胞中miR-200a的表達水平最低，因此選取A549細胞株作為進一步分析對象(圖1)。

圖1 miR-200a在不同細胞株中的相對表達水平

2.2miR-200a對A549細胞增殖的影響以吸光度為縱坐標、時間點為橫坐標，繪制細胞生長曲線。肉眼觀察并記錄克隆斑數目，計算克隆形成率，克隆形成率=(克隆形成數/接種細胞數)×100%。CCK-8法檢測A549細胞轉染miR-200a mimics、miR-NC后1～5天的OD值，并繪制生長曲線。結果顯示：與miR-NC組細胞相比，轉染miR-200a mimics細胞的OD值在4、5天時均降低(圖2)，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。平板克隆形成實驗顯示miR-200a mimics轉染組細胞克隆形成率為(33.13±0.74)%，明顯少于miR-NC組[(45.57±1.27)%]，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

圖2 轉染miR-200a mimics后A549細胞生長曲線

圖3 平板克隆形成實驗結果

A.miR-NC組；B.miR-200a mimics組；C.克隆形成率

2.3miR-200amimics對A549細胞遷移能力的影響Transwell細胞體外遷移能力檢測結果顯示，轉染miR-200a mimics穿膜細胞數為(71.60±17.90)個/孔，少于miR-NC組[(140.20±17.88)個/孔]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4)。

2.4miR-200amimics對A549細胞凋亡率的影響流式細胞術檢測轉染48 h后兩組細胞的凋亡率，結果顯示，miR-200a mimics和miR-NC組的細胞凋亡率分別為(17.80±1.90)%和(11.33±1.96)%，miR-200a mimics組的細胞凋亡率明顯高于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖5)。

圖4 Transwell遷移實驗結果

圖5 流式細胞術檢測檢測細胞凋亡結果

A.miR-NC組；B.miR-200a mimics組；C.細胞凋亡率

2.5miR-200a靶基因的預測利用miRWalk綜合數據庫，并取其中Targetscan、miRanda、RNAhybrid、miRWalk和Microt4共5種數據庫的計算結果取其交集，所得部分靶基因詳見表1。選擇其中1個潛在靶基因Tiam1利用TargetScan、DIANA-microT和miRanda常用數據庫反向預測Tiaml相互作用的miRNAs，結果顯示miR-200a可做為候選miRNA。TargetScan 數據庫顯示miR-200a與Tiaml的3’UTR區(qū)以不完全互補的方式結合。因此，我們推測Tiaml可作為miR-200a的靶基因進行下一步分析。

表1 利用miRWalk預測所得miR-200a的部分靶基因

3 討論

miRNA是大小為17～25個堿基的單鏈非編碼小分子RNA，廣泛存在于真核生物體內，通過與靶mRNA3’UTR的序列特異性結合，導致靶mRNA降解或翻譯抑制，出現轉錄后負調控靶基因的表達。預測分析約30%的人類蛋白編碼基因包括多種癌基因和抑癌基因受miRNA的調控。越來越多的證據表明，miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲與轉移及治療等方面具有重要作用[1]。由于miRNA在外周血、尿中穩(wěn)定性強，重復性好，且在石蠟標本也可提取，提示miRNA可作為腫瘤標志物以及腫瘤治療靶點的潛能。miRNA與NSCLC的增殖、侵襲和轉移也有密切關系，如miR-182[2]、miR-200[3]、miR-145[4]等可抑制NSCLC細胞增殖、侵襲和轉移。因此，積極探尋抑癌miRNA在NSCLC侵襲、轉移中的作用及其機制是當前肺癌研究熱點。

miR-200a作為miR-200家族(包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-114、miR-429)中的一員，定位于人1號染色體1p36.33。miR-200家族中的5個成員具有高度相似的種子序列，根據5’末端種子序列的相似性，將miR-200家族分為miR-200a/141和miR-200b/c/429兩個亞族。近年miR-200家族被認為能調控上皮-間質細胞轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，并且在某些腫瘤中表達下調促進腫瘤侵襲和轉移。Wang等[5]在對肝癌的研究中發(fā)現，miR-200a 在肝癌中表達下調，通過靶基因GAB1抑制癌細胞遷移和侵襲；miR-200a可靶向TFAM抑制乳腺癌細胞的增殖[6]。此外，在胃癌[7]、胰腺導管腺癌[8]、腎細胞癌[9]等腫瘤中也有類似作用。但在少數腫瘤中miR-200a也會表達上調，如miR-200a在結直腸中表達上調，通過靶基因PTEN促進細胞增殖、遷移和侵襲[10]；miR-200a在子宮內膜癌細胞中高表達，在細胞株HEC-1B中下調miR-200a可抑制細胞增殖并促進凋亡[11]。可見，miR-200a在不同腫瘤組織中的表達及作用部分有類似。目前，miR-200a在肺癌中的研究較少。Zhen等[12]發(fā)現miR-200a在肺癌細胞株表達低于正常肺上皮細胞株，過表達miR-200a可通過下調EGFR和c-MET抑制肺癌細胞遷移和侵襲。miR-200a在肺腺癌H1299細胞中的表達水平明顯低于人肺小氣道上皮細胞SAEC細胞，在轉移性肺癌細胞株中，miR-200a對多個癌基因具有抑制作用[13]。另有研究顯示，miR-200家族中miR-200a和miR-200c在肺腺癌細胞中的表達水平明顯低于永生化上皮細胞HBE[14]，本組結果支持上述部分結論。然而，miR-200a在肺癌細胞中的功能及作用機制仍不明確，本組通過轉染成熟體miR-200a mimics序列，上調miR-200a的表達，并對A549細胞生物學行為進行檢測。結果顯示，A549細胞生長受到抑制，細胞克隆率明顯減少，細胞的穿膜細胞數減少，表明miR-200a可以抑制肺癌細胞的增殖和遷移。流式細胞術檢測發(fā)現，上調miR-200a表達后，A549細胞的凋亡率顯著提高，以上結果表明miR-200a在肺癌中發(fā)揮抑癌基因作用，可抑制肺癌細胞增殖、遷移，并促進凋亡，提示hsa-miR-200a有可能作為肺癌治療的新靶點。為進一步探討miR-200a影響A549細胞增殖和遷移作用機制，本課題組從生物信息網站(TargetScan等)預測并篩選出Tiam1基因。Tiam1屬于鳥苷酸轉換因子家族成員，可調節(jié)Rho家族的小G蛋白。目前研究認為Tiaml主要通過選擇性激活Rac下游信號通路，從而實現調節(jié)連接細胞外信號與細胞骨架的通訊，參與腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉移等。我們前期研究[15]證實Tiaml在肺腺癌組織中高表達，其表達不僅與患者TNM分期和淋巴結轉移密切相關，其還是影響肺腺癌患者生存的獨立預后因素。文獻已證實，miR-200家族另一成員miR-141在肝癌中與Tiam1存在特異性結合[16]，miR-200a在肺癌中的直接作用靶基因是否是Tiam1，還需進一步實驗驗證。

miR-200a不僅調控靶基因的表達，還受到上游基因、轉錄因子及表觀遺傳等的調控。需要強調的是，miR-200a與其調控的靶點mRNA并非一對一的關系，兩者之間形成一個復雜和相互關聯(lián)的調控網絡。miR-200a的改變能引起一連串級聯(lián)反應和反饋通路，涉及多個mRNA和影響多個信號通路的靶基因。文獻報道m(xù)iR-200a作用于SIP1、ZEB1、ZEB2、SIRT1、TFAM等靶基因mRNA的3’UTR，參與EMT過程的調節(jié)，從而增加腫瘤侵襲和轉移的能力。另一方面miR-200a還可通過Wnt/β-catenin[17]、NF-κB[18]等信號通路參與腫瘤的進展。由于miR-200a可以靶向多種基因，除少數靶基因已得到鑒定外，miR-200a還存在其他未被認知的靶基因和作用機制。本課題組擬進一步驗證miR-200a的靶基因，并探討其表達的機制與腫瘤預后的關系，為肺癌的治療提供新的思路和治療靶點。

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EffectofmiR-200aontheproliferation,migrationandapoptosisoflungcancercelllineA549

LIU Shu-guang1, ZHANG Si-si2, SHAO Mu-min3, MA Hong-mei1, SHEN Hong2

(1DepartmentsofPathology,theEighthAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Shenzhen518033,China;2DepartmentofPathology,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;3DepartmentsofPathology,ShenzhenHospitalAffiliatedtoGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Shenzhen518033,China)

PurposeTo investigate the expression of miR-200a in different lung cancer cell lines and its effect on proliferation, migration, and apoptosis in A549 cells.MethodsThe expressions of miR-200a in different lung cancer cell lines were detected by RT-PCR. miR-200a mimics was transfected into A549 cells by Lipofectamine RNAiMax. The change of proliferation ablility of A549 cells was detected by CCK-8 method and plate clone formation assay. Cell migration was examined by Transwell chamber assay. The flow cytometry was used to examine the changes of apoptosis. The possible target genes of miR-200a were forecasted by bioinformatics tools.ResultsThe results of RT-PCR showed that the expression of miR-200a was significantly down-regulated in A549, H23 and H460 cell lines than 16HBE cell line. CCK-8 assay showed that the OD values of the mimics group at 4, and 5 days were significantly lower than those in the negative control (NC) group (P<0.05). Plate clone formation assay showed rate of colony formation in the mimics group was significantly lower than that in the NC group [(33.13±0.74)%vs(45.57±1.27)%,P<0.05]. Transwell migration assay showed that the cell number of mimics group that passed the Transwell membrane was significantly lower than that of the NC group [(71.60±17.90)vs(140.20±17.88),P<0.05]. Flow cytometry showed that the apoptosis rate of the mimics group was significantly higher than that of the NC group [(17.80±1.90)%vs(11.33±1.96)%,P<0.05]. Tiam1 may be one of the target gene of miR-200a.ConclusionmiR-200a can inhibit the proliferation and migration, and promote apoptosis of lung cancer A549 cells, suggesting a potential new therapeutic agent for lung cancer cell. MiR-200a may play a function of regulation of tumor development through target gene Tiam1.

lung neoplasm； miR-200a； A549 cells； proliferation； migration； apoptosis

時間：2017-9-18 6:23 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170918.0623.011.html

R 734.2

A

1001-7399(2017)09-0992-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.09.011

接受日期：2017-06-30

廣東省醫(yī)學科研基金資助(A2015429、A2016114)、深圳市福田區(qū)衛(wèi)生公益性科研項目(FTWS2015017)

1中山大學附屬第八醫(yī)院病理科，深圳 518033

2南方醫(yī)科大學病理學系，廣州 510515

3廣州中醫(yī)藥大學深圳附屬醫(yī)院病理科，深圳 518033

劉曙光，男，博士，副主任醫(yī)師。E-mail: SGL3016@163.com

申 洪，男，教授，博士生導師，通訊作者。E-mail: shenhong2010168@163.com