一種新型快速組織處理技術在病理標本處理中的應用

馬曉龍，李紅威，劉從容，王 華

一種新型快速組織處理技術在病理標本處理中的應用

馬曉龍1，李紅威2，劉從容1，王 華1

新型；快速組織處理；病理標本

目前，國內大部分醫院病理科仍采用傳統方法處理常規病理標本，整個過程耗時8～14 h，基本能滿足日常病理診斷的需要[1-2]。隨著現代醫院規模不斷擴大、病理科標本量增多、病床周轉率逐漸增高的現象日趨凸顯，病理診斷報告發放速度需隨之加快，這就需要縮短標本處理時間[3-4]。因此，有些快速組織處理方法也逐漸被多家病理科應用到常規工作中。本科室在實踐工作摸索出一種新型快速全自動組織脫水機聯合使用Fast Flex快速組織處理試劑的方法，可在2～4 h內通過4個步驟自動完成病理標本的處理。為全面評估這種新型快速組織處理技術的效果，同時采用新型快速組織處理方法和傳統組織處理方法，對不同類型組織在形態學、免疫組化及基因檢測等方面進行比較，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料收集北京大學第三醫院2013～2014年手術切除的病理標本45例，包括皮膚、扁桃體、甲狀腺、乳腺、肺、胃、結腸、肝臟、前列腺、輸卵管、子宮及尸檢腦組織，采用傳統常規組織處理方法完成整個流程，留取存檔冷凍組織庫中部分組織、采用快速處理程序進行處理。

1.2儀器(1)Tissue-Tek VIP6組織脫水機(Sakura)；(2)STP420ES新型自動組織脫水機(Thermo)；(3)全自動HE染色機(Leica ST5010)；(4)全自動免疫組化染色機(Benchmark XT，羅氏)；(5)Nanodrop DNA定量測定儀(Thermo)；(6)Real time-PCR儀(Qiagen，Agilent)。

1.3方法

1.3.1組織處理 大標本取材大小為2.0 cm×1.5 cm×0.2/0.3 cm[5]，合計33例。模擬穿刺組織(長1 cm，直徑約0.16 cm)及小活檢標本(直徑0.2～0.4 cm)合計12例。常規組標本采用10%中性福爾馬林固定6～24 h，快速組標本用Fast Flex Holding Solution固定2 h，分別在不同脫水機中使用常規試劑和Fast Flex快速組織試劑處理標本，其中快速組標本在不同溫度條件下依次通過3種快速脫水試劑及快速石蠟制劑，大標本處理時間為162 min，小標本處理時間為120 min。最后采用Leica石蠟包埋組織，4 μm厚切片，分別行HE染色及免疫組化染色。

1.3.2免疫組化 選擇18種常用一抗，陽性著色部位包括細胞膜、細胞質和細胞核。其中，HER-2、E-cadherin、CD20、CD38、CD3、CD117、CD99均為細胞膜著色；CK(AE1/AE3)、CK5/6、CK7、CK20、CK34βE12、CD68、SMA均為細胞質著色；ER、Ki-67、TTF-1、CDX-2均為細胞核著色。抗體分別購自DAKO、Leica及北京中杉金橋公司。除HER-2染色采用免疫組化自動染色機，其余均采用EnVision兩步法進行手工染色。陽性對照選用相應一抗陽性組織切片，TBS替代一抗作為空白對照。

1.4結果判斷

1.4.1HE染色評判標準 (1)按著色強度評判標準：深染為3分、中等染色為2分、淺染色為1分；(2)按細胞核、細胞質及細胞膜著色對比度評判標準：清晰為3分、部分清晰為2分、不清晰為1分；(3)按組織結構完整性評判標準：完整為3分、部分完整為2分、不完整為1分；(4)按細胞結構完整性評判標準：完整為3分、部分完整為2分、不完整為1分。4項得分相加為HE染色效果總分，滿分為12分[6]。

1.4.2免疫組化染色評判標準 免疫組化染色結果由兩位病理醫師進行評判；陽性信號為著色部位出現黃色或棕褐色顆粒。(1)按陽性信號定位的準確性判斷： 90%～100%陽性信號定位準確為3分、50%～89%信號定位準確為2分、<50%信號定位準確為1分；(2)按陽性信號強度判斷：棕褐色為3分、棕黃色為2分、淡黃色為1分、無著色為0分；(3)按陽性細胞比例判斷：>50%為3分、10%～50%為2分、<10%為1分、無陽性細胞為0分；三項相加作為該切片評分值，其中HER-2判讀標準參照《乳腺癌 HER-2檢測指南(2014版)》[7]。

1.5石蠟包埋組織DNA提取、熒光Realtime-PCR法檢測基因突變45例組織標本中選取病理診斷為非小細胞肺癌1例及結腸癌2例，10 μm厚石蠟切片5～10片，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN)試劑盒、按試劑盒說明書提取DNA。采用Nanodrop 1000定量測定儀測定樣本DNA純度和濃度。采用QIAGEN公司的EGFR RGQ PCR檢測試劑盒，檢測非小細胞肺癌EGFR基因18、19、20及21外顯子中的29種突變。采用艾德公司ADx-ARMS-Kras檢測試劑盒檢測結腸癌KRAS基因突變。每批反應均同時設陰陽性對照。反應結束后，通過熒光信號曲線及閾值線判讀檢測結果。

2 結果

2.1HE染色大組織：常規組HE染色各項得分均為3分，總平均分為12分；快速組總平均分為11.93分，其中HE染色強度平均3分、細胞核質對比度平均3分、組織結構完整性平均3分、細胞結構完整性平均2.93分；快速組中少數標本(3/45)的細胞膜結構稍欠清晰，但不影響病理組織學診斷。穿刺及小組織：快速組與常規組平均分均為12分。快速組處理的組織無論大小，其各項指標與常規組相比均無明顯差異(圖1、2)。

2.2免疫組化染色18種免疫組化抗體分別用于相應組織染色中，部分組織分別使用1～5種抗體，快速組和常規組各配套著染96張切片。快速組中各項免疫組化指標染色陽性定位準確，背景清晰，與常規組相比，兩組得分具有明顯正相關，其陽性著色部位、陽性強度及陽性細胞比例均無明顯差別(圖3～6)。

2.3基因突變檢測常規組和快速組中均檢測到一致性的基因突變，即1例肺癌標本中檢測到EGFR基因Exon-19缺失突變、Exon-20 T790M點突變(圖7)，2例腸癌標本中分別檢測到KRAS基因第2外顯子Codon-12中Gly12Val突變和Gly12Ala突變。

3 討論

組織脫水機的容量和速度是加快大量病理標本處理的關鍵。新型STP420ES自動組織脫水機的容量較大，并且根據組織大小不同，設有主缸和副缸，主缸有360個包埋盒，主要用于大標本處理，副缸有60個包埋盒，可處理小活檢及穿刺標本；主、副缸程序可同時或單獨運行。由于大、小標本分開處理，使脫水機的運行效率在保證各種組織充分脫水的同時得到明顯提高。更具特色的是，主反應缸的運行方式為滾筒式攪拌，可促進新鮮液體在組織周圍流動，通過旋轉方式定時交換化學試劑，使試劑與組織交換面積及效率較常規流程明顯提高，有效縮短標本的處理時間[8]。此外，該設備同時使用Fast Flex快速反應試劑，進一步加快脫水速度，整個標本處理時間由常規的8～12 h減少到2～4 h，使制片時間及后續病理報告發放周期明顯縮短，為需要進行特殊治療如靶向治療的患者贏得寶貴的治療時間。

本組采用快速組織處理技術制備的小活檢組織及穿刺組織，其HE染色效果較好，組織及細胞結構清晰，與常規組處理的效果無明顯差異。在小標本的取材方面，為了達到與實際工作相符合的效果，首次采用模擬穿刺組織和小活檢標本取材方法，這在以往研究中未見報道。多數大組織的切片染色效果與常規組無明顯差異，但少數大組織在細胞膜結構完整性上略有差異，可能與試劑在短時間內對于大標本的固定和穿透性欠佳有關，這些組織通過適當改進HE染色[9]，可以達到與常規組類似的效果。因此，在使用這套設備及試劑時，需根據組織類別、大小，適當調整染色細節，以確保組織處理的效果和質量；并應該嚴格界定標本的取材厚度不超過3 mm，這也是保證標本處理效果的前提。

①②③④⑤⑥

圖1常規組肝臟組織HE染色圖2快速組肝臟組織HE染色圖3常規組乳腺導管內癌中E-Cadherin呈陽性，EnVision兩步法

圖4快速組乳腺導管內癌中E-Cadherin呈陽性，EnVision兩步法圖5常規組乳腺導管內癌中ER呈陽性，EnVision兩步法圖6快速組乳腺導管內癌中ER呈陽性，EnVision兩步法

圖7 EGFR基因檢測：EGFR基因Exon-19缺失突變、Exon-20 T790M點突變

在免疫組化染色效果的評定方面，本組實驗選用病理外檢工作中常用的抗體，這些抗體著染部位包括細胞膜、細胞質及細胞核。實驗發現快速組處理的組織無論從著色部位、著色強度及陽性細胞比例上，與常規組均無明顯差異，提示快速組織處理技術亦能夠較好地保存細胞內的相關抗原。在基因突變檢測方面，快速組能夠檢測到與常規組一致的基因突變，提示快速組織處理技術能夠較好地保存細胞內的核酸。

綜上所述，本組實驗從形態學、免疫組化染色及基因檢測對新型快速組織處理技術處理的組織進行較全面的評估，結果顯示該項技術在組織處理速度和效率方面有一定的優勢，且不影響抗原表達和核酸分析；但需要指出的是，本實驗僅用少量標本進行測試，考慮到同樣試劑容量處理標本時，小樣本量的處理效果可能要優于大樣本量。目前，該項快速組織處理技術的效果尚需進一步實踐證明。

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時間：2017-9-18 6:23 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170918.0623.028.html

R 361

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1001-7399(2017)09-1046-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.09.028

接受日期：2017-07-09

1北京大學醫學部病理學系/北京大學第三醫院病理科，北京 100191

2北京市垂楊柳醫院病理科，北京 100022

馬曉龍，男，主管技師。E-mail: maxiaolong1998@sina.com

王 華，女，副教授，通訊作者。E-mail: hxwanghua@aliyun.com