芐嘧磺隆降解菌的分離及生長降解特性研究

陳 森，王 歡，陸 敏，韓麗珍

(貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

芐嘧磺隆降解菌的分離及生長降解特性研究

陳 森，王 歡，陸 敏，韓麗珍*

(貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

芐嘧磺隆是一種磺酰脲類除草劑，被廣泛應用于稻田土壤中防除一年生和多年生闊葉雜草。在土壤中的持效期較長，大量施用后易對后茬敏感作物產生藥害，微生物降解是土壤中芐嘧磺隆轉化的主要方式。本研究從長期施用該除草劑的稻田土壤中分離篩選到1株芐嘧磺隆降解菌株75B，經形態學及生理生化特征、16S rRNA基因擴增測序構建系統發育樹分析，鑒定為Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)。75B菌株對環境的適應能力較強，在pH 5.09.0、0.55.0% NaCl濃度下、培養溫度為2638℃的范圍內生長良好。將該菌株按5%接種量置于pH 7.0、以芐嘧磺隆為唯一碳源的無機鹽培養基(2.0% NaCl濃度)中、34℃條件下培養，對50 mg/L芐嘧磺隆的5 d降解率為74.11%，培養至10 d時的降解率為97.65%。結果表明75B菌株可以有效地降解芐嘧磺隆，具有應用于該除草劑污染環境修復的潛力。

芐嘧磺隆降解菌；肺炎克雷伯氏菌；生長降解特性

芐嘧磺隆(Bensulfuron-methyl， BSM)是一種磺酰脲類除草劑，可以抑制乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase， ALS)的活性，導致植物支鏈氨基酸的合成受阻而起殺草作用[1]。由于其選擇性高，對禾本科植物無害，因而被廣泛應用于稻田土壤中防除一年生和多年生闊葉雜草和莎草。芐嘧磺隆具有揮發性低、難以光降解，在堿性土壤中的持效期長達100 d以上的特征[2]。大量應用后不僅對后茬輪作作物有毒、損傷煙草和番茄等敏感作物，而且其殘留可通過滲濾增加鄰近水生環境污染的可能性[3]。研究已經證明BSM對水生蕨類和淡水藍藻有高度毒性[4]。較高濃度(3.553 mg/kg)BSM的處理可造成土壤微生物多樣性降低，嚴重抑制需氧性細菌、固氮菌、纖維素分解菌及氨化細菌的生長，減少了土壤固氮過程和硝化作用的進行[5]；還可導致Pseudomonasputida(惡臭假單胞菌)的急性毒性效應[6]。然而，利用14C標記技術對施加芐嘧磺隆的稻田土壤進行降解研究，發現重復施用BSM的稻田土壤中礦化產生14CO2的速率更快，表明土壤細菌可以利用BSM為碳源和能源[7]；顯然，通過微生物酶系統發揮的微生物降解仍然是芐嘧磺隆在土壤中轉化的決定性機制[8]。但是，自2005年首次分離到可以降解芐嘧磺隆的Brevibacteriumsp. BH菌株后，近年來芐嘧磺隆的降解微生物報道仍較少。為了豐富芐嘧磺隆的降解菌株，本研究從長期施用芐嘧磺隆除草劑的農田土壤中，分離篩選到1株Klebsiellapneumoniae，并對其生長降解特性進行了研究，以期為芐嘧磺隆污染土壤的生物修復提供理論依據和菌種資源。

1 材料與方法

1.1土樣采集

采集土樣來自貴州省貴陽市花溪區常年施用野老除草劑(含芐嘧磺隆 6%，乙草胺 16.7%)的稻田淹水土壤(北緯N26°26′18.23″，東經E106°39′45.32″，海拔1 125.35 m)，土壤為黃壤、pH值6.0。

1.2培養基

基礎鹽培養基(minimal sodium medium， MSM)：NH4NO31.0 g，NaCl 1.0 g，MgSO40.1 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌 30 min。

LB培養基：酵母膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌 30 min。

固體培養基均加入2.0%瓊脂。

1.3主要試劑及儀器

主要試劑：芐嘧磺隆標品(Sigma-Aldrich， USA)，10%芐嘧磺隆原藥(安徽華星化工股份有限公司)，除乙腈和甲醇為色譜純外，其余試劑均為國產分析純；分子生物學試劑Premix rTaq購自TakaRa，Bacterial DNA Kit購自Omega；主要儀器為T100 PCR儀(Bio-Rad， USA)，Chemi Doc XRS+凝膠成像儀(Bio-Rad， USA)，Waters 600高效液相色譜系統(Waters， USA)。

引物合成及產物測序均由上海英駿生物工程有限公司完成。

1.4芐嘧磺隆降解菌的分離

稱取土壤10.0 g加入100 mL含10 mg/L芐嘧磺隆的無機鹽培養基中，于30℃恒溫振蕩培養器中150 rpm振蕩培養，每隔10 d轉接一次，逐步提高培養基中的芐嘧磺隆濃度，連續馴化、富集培養6次，直至芐嘧磺隆濃度為250 mg/L。取最后一次富集培養液適量，稀釋后涂布培養于含50 mg/L芐嘧磺隆的MSM固體培養基上，30℃培養4 d左右，挑選生長良好的菌落進行分離純化并保種。

1.5芐嘧磺隆降解菌株的鑒定

1.5.1降解菌株的形態及生理生化鑒定 純化的單菌落接種到LB固體培養基中活化兩次后觀察菌落形態，挑取少量單菌落涂片進行Gram染色后光學顯微鏡觀察。生理生化的鑒定依照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[9]進行。

1.5.2降解菌株的分子鑒定 利用Bacterial DNA Kit提取細菌DNA，以降解菌DNA為模板，利用細菌16S rRNA基因擴增的通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)、1492r (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，有目的大小條帶者送出測序。測序獲得的16S r RNA基因序列使用BLAST進行同源性比較，同時聯合EzTaxon-e服務器的模式種細菌菌株比對進行分子鑒定。利用MEGA6.0中的鄰近法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹，進行1 000次自展檢驗。

1.6不同環境因素對芐嘧磺隆降解菌株生長的影響

1.6.1降解菌株的生長曲線 將活化菌液分別接種于LB培養基和含50 mg/L芐嘧磺隆的LB培養基中，使得培養液起始OD600值為0.2左右，于30℃ 150 rpm振蕩培養，定時取樣測定菌體生長量。

1.6.2培養基不同pH值對降解菌株生長的影響 將活化菌液接種于60 mL含50 mg/L芐嘧磺隆的LB培養基中，調節培養基pH值分別為 5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，于30℃ 150 rpm振蕩培養，定時取樣測定OD600值。

1.6.3培養基中不同NaCl濃度對降解菌株生長的影響 在含50 mg/L芐嘧磺隆的60 mL LB培養基中(原有NaCl濃度為0.5%)，分別添加NaCl使其鹽濃度分別為1.0、2.0和5.0%，接種菌液于30℃振蕩培養并測定OD600值。

1.6.4不同接種量對降解菌株生長的影響 將活化的菌液調節OD600值為1.0，按1.0、5.0、7.0和10.0%的接種量分別轉接入含50 mg/L芐嘧磺隆的60 mL LB培養基中，于30℃振蕩培養并測定OD600值。

1.6.5不同裝液量對降解菌生長的影響 分別取20、40和60 LB培養基(含50 mg/L芐嘧磺隆)裝入100 mL三角瓶中，接入菌液于30℃振蕩培養并測定OD600值。

1.6.6不同培養溫度對降解菌生長的影響 將活化菌液轉接入60 mL LB培養基(含50 mg/L芐嘧磺隆)中，分別在26、30、34和38℃條件下振蕩培養并測定OD600值。以上每個處理均設三個重復。

1.7降解菌株在以芐嘧磺隆為唯一碳源培養基中的生長及降解

將活化菌液6000 rpm離心5 min后棄上清，菌體沉淀用MSM培養液洗滌2次后重懸。重懸菌液分別接種于含50、100和150 mg/L芐嘧磺隆的MSM培養基中，在最適生長條件下置于恒溫搖床中150 rpm振蕩培養，定時取樣測定OD600值。每個處理設三個重復。選擇菌體生長較好的培養液處理后，HPLC測定其中的芐嘧磺隆濃度并計算降解率。

培養液中芐嘧磺隆的提取及濃度測定參考李陽陽方法[10]，簡而言之，取適量培養液加入3倍體積的二氯甲烷萃取、無水硫酸鈉吸去水分，經旋轉蒸發儀蒸干后加入色譜級甲醇溶解、過濾后利用HPLC測定培養液中的芐嘧磺隆含量。HPLC測定的色譜柱為AsilentTC-C18柱，以甲醇為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長為210 nm。

1.8數據處理

試驗數據處理采用Excel 2010和SPSS19.0軟件，多重比較采用LSD法。

2 結果與分析

2.1芐嘧磺隆降解菌株的分離與鑒定

利用長期使用野老除草劑的稻田土壤為材料，通過逐步提高培養基中芐嘧磺隆濃度的方法，經近兩個月的馴化及富集培養，最終分離純化獲得1個細菌菌株，該菌株在含50 mg/L芐嘧磺隆的MSM固體培養基平板上生良好，命名為75B。

降解菌株75B在LB固體平板上培養24 h后，呈現出半透明、光滑、隆起的乳白色光澤感菌落；鏡檢為G-的桿狀細菌(圖1)。生理生化測試表明，該菌株M.R試驗、V.P試驗、氧化酶及過氧化氫酶陰性；苯丙氨酸水解、淀粉水解、酪素水解陰性；硝酸鹽還原、纖維素分解、丙酸鹽利用陽性；有莢膜；可發酵葡萄糖、乳糖、核糖醇，不能利用山梨糖和5-酮基-D-葡萄糖酸。

利用16S rRNA基因擴增的通用引物，以75B菌株的總DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物經電泳顯示擴增到1.5 kb大小目的條帶。測序產物經BLAST及EzTaxon-e服務器鑒定，構建系統發育樹(圖2)，表明75B菌株的16S rRNA基因與Klebsiellavariicola及Klebsiellapneumoniae同源性極高，分子鑒定為Klebsiellasp.。

結合生理生化測定及分子生物學方法，最終將芐嘧磺隆降解菌75B鑒定為Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)。

圖1 芐嘧磺隆降解菌75B的菌落和鏡下Gram染色圖譜Fig.1 Colony and Cell Gram staining of Bensulfuron-methyl degrading strain 75B

2.2芐嘧磺隆降解菌株75B在不同環境條件下的生長

2.2.1降解菌株75B在不同培養基中的生長曲線 當把降解菌株75B接種入LB、含50 mg/L芐嘧磺隆的LB培養基中，結果顯示出相似的生長趨勢；另外，在LB培養基中加入50 mg/L芐嘧磺隆后，降解菌株75B的生長稍稍有所滯后，表明芐嘧磺隆的加入對于芐嘧磺隆降解菌株仍然存在略微的影響，這主要表現在對數生長期的生長速率有所降低。但是，當培養至穩定期后期(24 h)，在兩種培養基中的菌體生長量(OD600值)并未有顯著差別(p0.05)(圖3)，降解菌株可以快速適應芐嘧磺隆的存在。

圖2 芐嘧磺隆降解菌75B的16S rRNA基因系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tress on 16S rRNA gene of Bensulfuron-methyl degrading strain 75B

圖3 芐嘧磺隆降解菌株75B的生長曲線Fig.3 Growth curves of Bensulfuron-methyl degrading strain 75B

2.2.2培養基不同pH值及NaCl濃度對降解菌株生長的影響 在不同pH值的LB培養基(含50 mg/L芐嘧磺隆)中，降解菌株75B的菌體生長量在對數生長期存在差異，pH 7.0的培養基中生長速率最快(p0.05)，最適pH值為7.0。進入穩定期后期，pH值對菌體生長量的影響下降，該菌株在pH 5.09.0范圍內生長良好，表明75B對環境pH值有較強的適應能力(圖4)。

2.2.3不同接種量及裝液量對降解菌株生長的影響 設置4個不同接種量接種菌液，結果表明，在接種量為1%時，75B菌株的菌體生長量低于其余3個處理，而當接種量為5.0～10.0%范圍內時，菌體OD600值并無顯著差異(p<0.05)。 因而，適當加大接種量可使菌體縮短適應期而進入快速生長階段，但接種量與菌體生長量之間并不呈完全對應增長趨勢，降解菌株75B的最適接種量為5.0%。而在3個不同的裝液體積下，菌體生長量并無明顯差異(圖5)。

注：上圖為不同pH值，下圖為不同NaCl濃度，*代表差異顯著(p0.05)

圖4 培養基不同pH值及NaCl濃度對芐嘧磺隆降解菌株75B生長的影響
Fig.4 Growth Effects on different pH and NaCl concentration of Bensulfuron-methyl degrading strain 75B

2.2.4不同培養溫度對降解菌株生長的影響 溫度通常對微生物的生長影響較大。在4個不同的溫度條件下培養75B菌株，34℃條件下的菌體生長量略高；除在培養初期(12 h)，測試的最低溫度(26℃)及最高溫度(38℃)下菌體OD600值略低于其余處理外；總體上，在26～38℃溫度范圍內，芐嘧磺隆降解菌株75B的生長良好，菌株可以耐受較廣的溫度范圍。

注：上圖為不同接種量，下圖為不同裝液量，*代表差異顯著(p0.05)

圖5 接種量及裝液量對芐嘧磺隆降解菌株75B生長的影響
Fig.5 Growth Effects on different inoculum size and medium volume of Bensulfuron-methyl degrading strain 75B

圖6 不同培養溫度對芐嘧磺隆降解菌75B生長的影響Fig.6 Growth Effects on different temperature of Bensulfuron-methyl degrading strain75B

2.3芐嘧磺隆降解菌株75B的生長及降解

將活化的75B菌株培養液以5%接種量、轉接入以芐嘧磺隆為唯一碳源的無機鹽培養基(pH 7.0，含2.0% NaCl)中，34℃搖床振蕩培養監測菌體生長量。結果表明，菌體在150 mg/L芐嘧磺隆的培養基中基本無生長；而50 mg/L和100 mg/L濃度下菌體的延滯期達3 d左右，之后OD600值開始逐漸呈上升趨勢。在含50 mg/L芐嘧磺隆的MSM培養基中，75B菌株的生長明顯優于另兩組處理(p0.05)(圖7)。收集該濃度下的菌體培養液，經萃取、蒸干后進行HPLC測定，顯示75B菌株對50 mg/L芐嘧磺隆的5 d降解率為74.11%，培養至10 d時的降解率高達97.65%(圖8)。

注：*代表差異顯著(p0.05)

圖7 降解菌株75B在以不同濃度芐嘧磺隆為唯一碳源MSM培養基中的生長
Fig.7 Growth on MSM containing different concentration Bensulfuron-methyl of strain 75B

圖8 芐嘧磺隆降解菌株75B對50 mg/L芐嘧磺隆的降解能力Fig.8 Degrading capability on 50 mg/L Bensulfuron-methyl of strain 75B

3 結 論

芐嘧磺隆是20世紀80年代中期開發的一種新型磺酰脲類除草劑，是我國水稻田中使用面積廣、時間長、用量大的除草劑之一。由于其在土壤中的持效期較長，大量施用后會對環境造成一定危害。本研究采集長期施用野老除草劑(含芐嘧磺隆6%)的稻田土壤，經富集、馴化后分離到1株芐嘧磺隆降解菌株75B，形態學、生理生化研究及分子生物學研究結果顯示該菌株為Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)，該菌株對環境的適應能力較強，生長在pH 7.0、含50 mg/L芐嘧磺隆的無機鹽培養基(2.0%NaCl)中，34℃條件下培養10 d，對芐嘧磺隆的降解率可達97.65%。

Zhu等在2005年首次報道可降解芐嘧磺隆的短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)BH菌株，在2535℃條件下、pH7.07.5時，培養7 d對100 mg/L BSM的降解率為29.4%[11]。張松柏等從農藥廠工業廢水和污泥中富集分離到光合細菌PSB07-6，鑒定為Rhodopseudomonaspalustris(沼澤紅假單胞菌)，在pH6.5的光合細菌培養基中30℃條件下培養5 d后，對350 mg/L芐嘧磺隆的降解率為25.03%[12]。Lin等分離到BacillusmegateriumL1菌株，培養84 h對50 mg/L BSM的降解率為12.8%[13]。Xiong等篩選到的Rhodococcussp. BX2菌株對20 mg/L BSM的7d降解率為92%[14]。除此外，彭星星等分離篩選到的芐嘧磺隆降解真菌Aspergillussp. BP-H-01菌株，最適pH 7.5、28℃條件下對25 mg/L BSM的2 d降解率為84.5%[15]。Peng等分離到Penicilliumpinophilum(嗜松青霉) BP-H-02菌株，在30℃條件下置于pH 6.5的培養基中，對50 mg/L BSM的60 h降解率為87%[16]。以上報道的芐嘧磺隆降解菌株最適pH值均為中性或酸性條件。Sabadie等的研究表明BSM在土壤中主要經化學水解和生物學降解進行，其化學水解是pH依賴性的、在酸性或中性條件下(pH8.0)可通過脲橋斷裂水解形成穩定的嘧啶胺和苯甲磺酰氨[17]。本研究獲得的Klebsiellapneumoniae75B菌株在堿性條件下(pH 7.09.0)生長良好，更有利于堿性土壤中生物降解的進行。另外，該菌株的溫度適應范圍(2638℃)更廣、對50 mg/L芐嘧磺隆的5 d降解率可達74.11%，培養至10 d時幾乎可完全降解，是一株降解效果優良的菌株，對于該菌株的進一步研究可為其用于污染土壤的生物修復奠定基礎。

Klebsiella屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，在環境中廣泛存在，其分離株或具有內生性固氮作用、或者是條件性致病菌[18]。Klebsiellapneumoniae是可定殖和感染多種動植物的克雷伯氏菌屬成員[19]。早期的研究表明該菌為條件性致病菌，可致人肺炎及奶牛乳腺炎[20]。近年來發現Klebsiellapneumoniae分離株具有代謝多樣性，占據了不同類型的環境生態位；菌種的不同分離株也表現出遺傳和表型的多樣性[21]。多位研究者發現在玉米或水稻中有該種微生物內生定殖并具有固氮活性[22]，而且玉米分離株較臨床分離株的毒力更低[23]。Klebsiellapneumoniae不同地區分離株還被報道具有降解石油、降解苯并芘和芘，可利用單寧酸[24]等多種能力。本研究中分離到的Klebsiellapneumoniae菌株被首次發現還具有降解芐嘧磺隆的能力，也充分表明了該種微生物具有一定的環境生物修復潛能。

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Isolation，GrowthandDegradationCharacteristicsofBensulfuron-methylDegradingStrain

CHENSen，WANGHuan，LUMin，HANLi-zhen*

(CollegeofLifeSciences，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China)

Bensulfuron-methyl(BSM) is a kind of sulfonylurea herbicide and widely used to control broad-leaf weeds in paddy fields. Over-utilization can have negative impact on damaging sensitive succeeding crops because of BSM’s long persistence. Microbial degradation was considered to be the main mechanisms of reducing bensulfuron-methyl herbicide in soil. In this study， A BSM-degrading bacterium， strain 75B， was isolated from paddy soil used this herbicide several years. It was identified asKlebsiellapneumoniaebased on its morphological， physiological， biochemical properties， and phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences. Strain 75B grew well at pH 5.0 to 9.0， 0.5% to 5.0% NaCl concentration and temperature range from 26℃ to 38℃. Under optimal conditions (5% inoculum size， pH 7.0 minimal salt medium containing 2.0% NaCl concentration， culture temperature 34℃)， 74.11% of the initially added BSM (50 mg/L) was degraded after 5 days and almost complete degradation (97.65%) could be achieved after 10 days. These results revealed that 75B can biodegrade bensulfuron-methyl efficiently and could potentially be used to bioremediate sulphonylurea herbicides contamination.

Bensulfuron-methyl degrading bacteria；Klebsiellapneumoniae； growth and degrading characteristics

2017-06-28；

2017-09-19

貴州省自然科學基金項目(黔科合J字[2014]2065號)。

*

韓麗珍(1972-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要研究方向：環境微生物及微生物生態學；E-mail： hanlizhen11@163.com。

Q939.9

A

1008-0457(2017)05-0046-07國際DOI編碼10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.05.008