基于末端脫氧核苷酸轉移酶擴增DNA銅納米簇熒光傳感檢測L組氨酸

肖慧+何婧琳+肖昊+楊嬋+馮澤猛+印遇龍+曹忠

摘 要 利用末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）擴增形成聚胸腺嘧啶（T）DNA模板，制備了聚T銅納米簇（TSCuNCs），構建了一種用于L組氨酸（LHis）檢測的熒光傳感分析新方法。TdT酶在dTTP存在下合成聚T單鏈DNA核苷酸序列。由于胸腺嘧啶和Cu2+之間的親合力，聚T單鏈DNA作為合成銅納米簇（CuNCs）的模板，加入還原劑后形成CuNCs，熒光強度增強。在LHis存在下，L組氨酸的咪唑基與Cu2+螯合形成LHisCu2+配合物，因而進入聚胸腺嘧啶序列中的Cu2+量減少，使得合成的CuNCs數量減少，導致熒光信號減弱。實驗結果表明，體系熒光響應信號與LHis濃度的對數值在5.0×10mol/L范圍內呈線性關系，檢出限達到3.4×10 mol/L。本方法用于實際尿液樣品中L組氨酸檢測的回收率為97.4%～104.6%，在生物醫學及臨床診斷中具有潛在應用價值。

1 引 言

L組氨酸（LHis）作為神經調節劑或神經遞質控制金屬元素的運輸，其持續性缺乏常伴隨著弗里德里希共濟失調、癲癇、帕金森病和紅細胞生成發育不正常[1]。LHis過量也會導致AIDS、慢性腎臟疾病[6]、阿爾茨海默病和癌癥等[2]。因此，構建靈敏、高效檢測LHis的方法對臨床醫學有重要意義。

目前，檢測LHis的方法主要有比色法[3]、分光光度法[4]、液相色譜法[5]、毛細管電泳法[6]、質譜法[7]、拉曼光譜法[8]等，這些方法大多存在干擾因素多、操作復雜、分析成本高等不足。近年來，LHis熒光傳感器由于高效、靈敏等優點引起廣泛關注[3]，主要的測定原理： 一是核酶切割法，如Kong等[9]采用酶催化循環切割擴增單分子DNA實現對LHis的檢測，樣品用量少； He等[10]構建酶級聯指數擴增傳感平臺檢測LHis，選擇性好； 二是量子點恢復法，Hou等[11]基于碳量子點Hg（II）體系熒光恢復策略，LHis檢出限為0.15 μmol/L； 三是金屬納米簇法，Gong等[12]提出銀納米簇（AgNCs）免標記催化和分子信標擴增傳感策略，LHis檢出限為17 μmol/L，但所合成AgNCs成本較高，操作條件較苛刻。

2.2 L組氨酸與Cu2+的作用

用0.01 mol/L MOPS緩沖液（含0.05 mol/L NaCl，pH=7.8）配制5.0×10 mol/L LHis儲備液，逐級稀釋至5.0×10

2.3 TdT酶擴增聚T單鏈DNA （TS）模板的制備

用0.01 mol/L MOPS配制1.0×10mol/L引物鏈P1儲備液，于4℃保存。在10 μL 1×TdT酶緩沖液中，依次加入5 μL 2 μmol/L P1，0.2 μL 100 mmol/L dTTP和4 U TdT酶， 37℃孵育2 h，然后加熱至75℃保持10 min，冷卻至室溫，形成混合溶液B。

2.4 TSCuNCs的制備與熒光檢測

取上述溶液B，加入3.0×10mol/L抗壞血酸鈉，充分反應5 min后，置于F7000光譜儀中檢測熒光。激發波長為340 nm，發射波長為600 nm，激發和發射狹縫均為10.0 nm。

2.5 L組氨酸的檢測

將上述CuSO4與一系列不同濃度LHis結合的溶液A與溶液B混合，加入2.0×103 mol/L抗壞血酸鈉，充分反應5 min后檢測熒光強度。

3 結果與討論

3.1 檢測原理

如圖1所示，LHis的咪唑基與Cu2+反應，形成2∶1穩定螯合物。TdT酶在dTTP存在下擴增引物鏈P1形成聚T單鏈DNA核苷酸序列（TS），加入Cu2+時，由于T堿基和Cu2+之間存在親合力，以聚T序列作為合成CuNCs的模板，加入抗壞血酸鈉還原Cu2+，形成大量CuNCs，產生強熒光信號。加入LHis形成LHisCu2+配合物時，進入聚T單鏈DNA結構中的Cu2+量少，合成的CuNCs含量少，熒光信號弱。

3.2 TdT酶擴增DNA模板CuNCs各組分熒光光譜

為考察上述競爭反應，測定了體系P1、Cu2+/LHis混合物、P1/Cu2+/LHis混合物、TS、TS/Cu2+混合物、TSCuNCs存在和不存在LHis的熒光光譜圖。如圖2所示，前5種體系均無熒光報告基團，不產生熒光信號（曲線a， b， c， d， e）； 曲線f有強熒光信號，因為在空白實驗中，Cu2+無消耗，形成大量CuNCs，得到強熒光信號。當有LHis存在時，熒光信號顯著降低（曲線g），這是因為Cu2+先與LHis螯合，剩余的Cu2+再與聚T序列作用，還原成CuNCs的量少，所以熒光信號弱。因此， 基于競爭反應原理檢測LHis是可行的。

3.3 條件優化

3.3.1 酶反應引物序列的選擇 由于引物鏈（P1、P2、P3）序列不同，其二級結構會影響后續熒光信號輸出，為得到最佳引物序列，將P1、P2、P3作為TdT酶底物鏈合成CuNCs，并考察LHis對其熒光的影響程度，如圖3A所示。不存在LHis時，其熒光強度因DNA序列的不同而不同，P1最高， P3最低。其中，P1的3′GGACATA是多種堿基序列，加入TdT酶之后，在P1 3′端聚合形成聚T長鏈，由于T堿基與Cu2+的親和作用合成CuNCs而發射較強熒光； 而P2的3′AAAAAAA是單一A堿基序列，能夠與TdT酶聚合產物中的聚T結構互補配對，形成部分雙鏈結構，導致CuNCs合成減少，熒光強度下降； P3為P1+P2序列長鏈，其5′TTTTTTT和3′AAAAAAA可以互相雜交而形成分子內部分雙鏈結構，二級結構較復雜，在溶液中很難以單鏈狀態存在，導致TdT酶聚合效率不高，CuNCs合成很少，熒光信號很弱。加入LHis之后，熒光信號均顯著降低，這是因為LHis與Cu2+發生配位反應，難以合成CuNCs。因此，選擇信背比最佳的P1作為后續實驗的引物鏈。endprint

同時，選擇化學合成的T5（5′（T）53′）、T10（5′（T）103′）、T20（5′（T）203′）、T30（5′（T）303′）和T40（5′（T）403′），考察T5、T10、T20、T30和T40直接合成CuNCs（圖3B虛線）和以它們作為引物經過TdT酶擴增后合成CuNCs（圖3B實線）得到的熒光發射光譜圖。結果表明， 采用TdT酶擴增DNA引物產生含有polyT的DNA比直接使用化學合成polyT引物DNA合成銅簇的熒光更強，效果更好。

3.3.2 酶孵育時間優化 由于TdT酶催化DNA擴增是一個逐步增加T堿基的過程，延伸產物鏈長依賴于擴增反應時間。考察了酶孵育時間對延伸長度的影響。引物鏈P1加入TdT酶孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h，在2.0 h前，P1在TdT酶作用下迅速聚合，熒光強度逐步增加； 2.0 h后，熒光信號趨于穩定，TdT酶效率顯著下降。因此，選擇最佳酶孵育時間為2.0 h。

3.3.3 Cu2+濃度優化 為了高效檢測LHis，找到最佳信號輸出時的Cu2+濃度，考察了Cu2+濃度對傳感體系熒光信號的影響。無LHis存在時，Cu2+濃度在1.5×10mol/L范圍內， 體系熒光強度呈上升趨勢，之后趨于穩定。加入LHis （5.0×10

3.3.4 抗壞血酸鈉濃度優化 考察了系列抗壞血酸鈉濃度對傳感體系熒光響應信號的影響。結果表明，無論LHis是否存在，抗壞血酸鈉濃度在5.0×10mol/L范圍內，熒光強度均隨抗壞血酸鈉濃度的增加而迅速上升，這是因為隨著抗壞血酸鈉濃度增加，被還原的Cu0增加，合成的CuNCs增加，導致熒光增強； 抗壞血酸鈉濃度達到1.0×10 mol/L后，反應達到平衡，熒光信號趨于穩定。因此，抗壞血酸鈉的最佳濃度為1.0×10

3.4 分析性能測試

考察了TdT酶擴增TSCuNCs傳感體系在系列LHis濃度下的熒光發射光譜。如圖4A所示，傳感體系的熒光強度隨LHis濃度的上升而依次遞減，在5.0×10mol/L； （B） Calibration curve of fluorescence intensity of the proposed sensors vs. the logarithm value of LHis concentration

3.5 方法的選擇性

為了考察此傳感體系對LHis的特異性識別性能，對生物體中普遍存在的多種氨基酸進行測試，如： L絲氨酸、L酪氨酸、L脯氨酸、L天門冬氨酸、L亮氨酸、L異亮氨酸、L賴氨酸。LHis的濃度為4.0×100.07之間。可見，當其它氨基酸的濃度為LHis濃度的5倍時，不會影響該傳感體系性能。這表明其它氨基酸存在時，對體系熒光強度的干擾很小，即傳感體系對LHis有特異性識別能力。

3.6 回收率

為了驗證TdT酶擴增TSCuNCs傳感體系檢測LHis的實用性，對未經處理的成人晨尿樣進行分析研究。在優化實驗條件下，用0.01 mol/L MOPS緩沖液（含0.05 mol/L NaCl，pH=7.8）將尿樣稀釋200倍，采用加標回收法測定樣品，回收率為97.4%～104.6%（見表2）。另取2個尿樣進行檢測，發現呈陽性，測得LHis濃度分別為1.13 和2.29 μmol/L， 表明此傳感方法對實際樣品中L組氨酸的檢測具有實用性。

與貴金屬納米簇相比，以雙鏈DNA為模板合成銅納米簇（CuNCs）的熒光方法已用于LHis的檢測[13]，聚T單鏈DNA也可作為合成CuNCs的模板[14]，用于檢測堿性磷酸酶[15]、三聚氰胺[16]和Cu2+等[17]。然而，以上DNA模板均由化學合成而來。Peng等[18]利用末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）生物合成聚T單鏈DNA，以此為模板合成CuNCs，用于檢測相關酶活性，與化學合成CuNCs的方法相比，該方法具有更高的熒光響應信號。文獻[19，20]構建了一系列基于TdT酶擴增的熒光方法檢測不同目標物，但以聚T單鏈DNA為模板合成CuNCs用于LHis的檢測鮮有報道。因此，本研究基于DNA中胸腺嘧啶和LHis對Cu2+的競爭反應，構建一種基于TdT酶擴增聚T單鏈DNA銅納米簇熒光方法，實現了對LHis無標記高靈敏檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

F7000熒光分光光度計（日本日立公司）； PHSJ3F電位計（上海雷磁儀器廠）； BXM30R立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司）； 恒溫金屬浴（杭州博日科技有限公司）； KQ3200B超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）。

DNA和dTTP（上海生工生物工程股份有限公司）； P1 5′端聚T，P2 3′端聚A，P3含有P1和P2序列（見表1）； TdT酶 （20 U/μL）、5×TdT酶緩沖液（美國Fermentas公司）； 3（N嗎啉基）丙磺酸（MOPS）、L組氨酸、抗壞血酸鈉 （美國SigmaAldrich公司）； CuSO4、NaOH、NaCl（國藥集團化學試劑有限公司）； L絲氨酸、L酪氨酸、L脯氨酸、L天門冬氨酸、L亮氨酸、L異亮氨酸、L賴氨酸（阿拉丁試劑有限公司）。所用試劑均為分析純。實驗用水均為超純水（電阻率≥18.25 MΩ·cm）。endprint