腹瀉仔豬中豬圓環病毒2型的檢測及生物信息學分析

平 措 ， 許思遙 ，徐志文 ，朱 玲

（1．四川農業大學動物醫學院，四川 成都 611130；2．西藏林芝市巴宜區農牧局獸防站， 西藏 林芝 860100）

腹瀉仔豬中豬圓環病毒2型的檢測及生物信息學分析

平 措1，2， 許思遙1，徐志文1，朱 玲1

（1．四川農業大學動物醫學院，四川 成都 611130；2．西藏林芝市巴宜區農牧局獸防站， 西藏 林芝 860100）

為研究仔豬腹瀉中豬圓環病毒2型(PCV2)的生物信息，參考GenBank發表的豬圓環病毒2型(PCV2)全基因組序列，設計并合成一對特異性引物，從四川地區豬場送檢的腹瀉仔豬病料中擴增PCV2全長基因序列，回收PCR產物。將其插入PMD19-T載體，構建了重組質粒，轉化后篩選、提取陽性重組質粒進行測序。將測序結果及推導的氨基酸序列與國內外的不同分離株進行生物信息學分析。結果表明，分離株基因組全長為1 767 bp，分離的三株基因組與GenBank上已發表的PCV2分離株之間的核苷酸同源性分別為1#94．7%～89．6%、2#94．7%～89．3%、3#96．4%～86．8%，氨基酸序列同源性為1#97．9%～95．7%、2#97．1%～95．5%、3#98．4%～94．8%，說明四川地區腹瀉仔豬病料中PCV2的變異相對保守。

豬圓環病毒2型；PCR檢測；生物信息學分析

圓環豬病毒（porcine circovirus，PCV）在1974年首次由德國學者Tischer在PK-15細胞培養污染物中分離得到[1]，在分類學上屬圓環病毒科圓環病毒屬，它是一種無囊膜的單股負鏈環狀DNA病毒，為已知的最小的動物病毒之一。病毒粒子直徑14～17 nm，呈20面體對稱結構，無囊膜，含有共價閉合的單股環狀負鏈DNA，基因組大小約為1.76 kb。PCV對外界理化因子的抵抗力相當強，即便在pH3的酸性環境及72 ℃的高溫環境中也能存活一段時間，氯仿作用不失活，無血凝活性[2，3]。致病性和核酸序列的不同，分為1型(PCV1)和2型(PCV2)[4]，近期有報道發現3型(PCV3)[5]。PCV1基因組長1 759 bp，PCV2基因組長1 767～1 768 bp，PCV3基 因 組長2 000 bp。研究發現，PCV2含有11個ORFs，有兩個主要即ORF1和ORF2[7]。ORF1編碼復制酶相關的rep蛋白，該蛋白氨基酸序列相當保守，是與PCV1產生抗原交叉性的主要部位；ORF2編碼病毒的核衣殼蛋白[8，9]。PCV2和PCV1、PCV3間氨基酸序列同源性較低，差異較為明顯[10]。豬對PCV2具有較強的易感性，感染豬可自鼻液、糞便等代謝廢物中排出病毒，經口腔、呼吸道途徑感染不同年齡的豬。

PCV2為致病性的病毒[11]，是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)、仔豬先天性震顫（CT）、增生性壞死性肺炎（PNP）、豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）、繁殖障礙、腸炎等多種疾病的病原[12]。腹瀉是豬的一種常見病，發病率高，常發病于冬春、夏秋的交替期。近年仔豬冬季腹瀉情況多發，并且仔豬腹瀉表現為發病率高，致死率高的整體情況。近年全國范圍內仔豬腹瀉發病率高、死亡率高，造成較大經濟損失，已成為影響我國養豬產業發展的一大障礙。豬腹瀉中仔豬腹瀉占總量的比重較大，多發于1～3月齡的斷奶仔豬，腹瀉引起的死亡占仔豬死亡總數的40%。低日齡仔豬感染PCV2后繼發感染其他病原報道時有發生，尤其以腹瀉為典型臨床特征的病例更是常有報道，血清學調查表明，PCV在世界范圍內流行[13]。圓環病毒（PCV）被列為世界公認的當前危害養豬業發展的頭號疫病[14，15]，已引起世界各國的廣泛關注。這次實驗通過PCR方法在仔豬腹瀉病料中克隆PCV2全基因，并與GenBank中的參考序列比較分析，有助于了解不同地區的PCV2毒株序列的同源性差異，為仔豬腹瀉病料中PCV2的分子生物學及分子流行病學調查提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗病料

病料的采集：病料主要來源2016年10月至2017年6月四川地區某豬場送檢腹瀉仔豬組織樣品，采集患腹瀉的死豬的病料組織樣品進行檢測。

PCV2陽性病料由四川農業大學生物技術中心保存并提供。

病料的處理：采取剖解豬的腹股溝淋巴結、脾臟、肺臟、肝臟等組織作為檢測PCV2的材料，加入少許PBS溶液，-70 ℃反復凍融3次，在研缽中經行無菌研磨，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

表1 主要儀器

表2 DNA提取產物的PCR反應體系

1.1.2 實驗試劑

DL2000 Marker、Marker III 購TIANGEN生物制品公司；2xTaq PCR master Mix 購 自 TaKa-Ra；氯仿，異丙醇，75%乙醇，TE；10 mg/mL EB JC存液：以l0 mg/mL濃度將EB溶于雙蒸水中，劇烈攪拌，完全溶解后，室溫下避光保存。

實驗材料由四川農業大學生物技術中心提供。

1.1.3 主要儀器

主要儀器見表1。

1.1.4 引物的設計與合成

參照GenBank發表的PCV2全基因序列，通過Primer Premier 5.0生物軟件設計出一對特異性引物。其序列如下：

1.2 方法

1.2.1 病料病毒DNA的提取方法

1）取病料研磨后取上清液離心（12 000 r/min×5 min） 后 去 400 μL上清液，加500 μL飽和酚后混勻靜置5 min。

圖1 PCV2基因的PCR電泳產物

2）再次離心（12 000 r/min×5min）后取上清液加入飽和酚、氯仿各200 μL， 混 勻 靜 置 5 min后 離 心（12 000 r/min×5 min）

3）重復步驟2）。

4）再取上清液加入氯仿400 uL，混勻靜置5 min后離心（12 000 r/min×5 min）。

5）離心后取上清液加入2倍體積異丙醇輕搖2 min后靜置放入冰箱（-20 ℃）10 min，

6）取出離心（12 000 r/min×5 min）。離心后棄上清液，用75%的冰乙醇1 mL清洗沉淀及管壁后離心（12 000 r/min×5 min）。

7）離心后棄上清液，室溫干燥沉淀。最后加入30～50 μL TE溶解干燥沉淀，放入-20 ℃保存。

1.2.2 DNA提取產物的PCR擴增

采用10 μL體系進行PCR擴增。PCR反應體系為（見表2）：

PCR反應程序為：預變性：95 ℃ 4 min、變性 ：95 ℃ 30 s、退火：52.8 ℃ 30 s、延伸：72 ℃ 30 s，反應35個循環、終延伸：72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

表3 目的片段PCR反應體系

表4 國內外某些PCV2的登錄號及來源

1.2.3 PCR擴增產物電泳將PCR產物加入制作好的瓊脂糖凝膠孔中，采用DL 2000 marker，進行電泳。

1.2.4 凝膠成像及對照

利用凝膠成像儀成像，并對結果進行陰陽性對照。在電泳緩沖液中，5 V/cm電壓，電泳30 min。最終獲得長度約為1 767 bp的片段，與預期擴增的片段長度相符。

1.2.3 目的DNA片段的回收與連接

按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書進行，取30～50μL的回收產物置-20 ℃備存。

將回收好的目的片段與PMD19-T simple Vector 連接，反應體系為（見表3）。

1.2.4 DH5α感受態細胞的制備

無菌條件下用挑取DH5α大腸桿菌多個菌落，接種于10 mL的LB肉湯中，37 ℃水浴振蕩培養過夜，次日取1 mL DH5α菌液接種于20 mL的LB培養基中，37 ℃水浴振蕩培養至OD 0.6左右，將菌液轉移至15 mL離心 管， 冰 浴 10 min ，3 000 r/min ，離心5 min ，棄上清，將菌體懸浮在10 mL 0.1 mol/L CaCl2中，冰浴10 min，3 000 r/min，4 ℃ 離 心 5 min ，棄上清，將菌體重懸于10 mL 0.1 mol/L CaCl2，冰浴中放置12 h。

1.2.5 連接物的轉化、陽性克隆菌落挑選和鑒定

取100 μL上述制備的感受態細胞，加入10 μL連接產物并攪拌混勻，先冰浴30 min，然后42 ℃水浴2 min ，再冰浴5 min，加入0.9 mL LB液體培養基，37 ℃水浴振蕩1 h，將200 μL轉化菌涂布于LB/Amp/X-Gal/IPTG 瓊脂固體培養基，置37 ℃培養12 h，觀察菌落生長情況，篩選出重組轉化體。再將其接種于10 mL LB/Amp/X-Gal/IPTG液體培養基中，于37 ℃以220 r／min搖振培養過夜。用菌液PCR挑選出陽性克隆菌落。通過電泳檢測，克隆的陽性重組質粒均帶有相應的目的片段。檢測為陽性，說明轉化成功。

取菌落PCR鑒定為陽性的菌液送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。

2 結果

2.1 PCV2基因核苷酸序列同源性分析結果

利用DNA Star，NCBI等軟件拼接、比對，確定測序結果為PCV2。將所得序列與NCIBI數據庫中收錄的國內外部分PCV2基因序列（表4）進行核苷酸的同源性比較。

將本次實驗獲得的3株PCV2基因序列，與NCBI數據庫里的十株PCV2基因和完整的PCV2基因序列，運用DNA Star軟件進行同源性分析。

1號PCV2基因組與國外四株PCV基因組加拿大株（AF027217）、美國株（AY391927）、法國株（HM623764）和丹麥株（FJ935780）同源性分別為96.2%、97.7%、95.7%和 97.9%， 同源性相對較高且相差2.2%。在與國內6株PCV基因組浙江株（AY188355）（AY651850）、 北 京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 東 株（AY536755） 和 廣 東 株（JX294717）的同源性在97.9%-96.1%之間，1號PCV2毒株與浙江株（AY188355）及山東株（AY536755）的同源性最高，達到97.9%。同源性最低的是北京株（AF381175），為96.1%。

2號PCV2基因組與國外四株PCV基因組加拿大株（AF027217）、美國株（AY391927）、法國株（HM623764）和丹麥株（FJ935780）同源性分別為96.1%、97.0%、95.5%和 97.1%， 同源性相對較高且相差1.6%。在與國內6株PCV基因組浙江株（AY188355）（AY651850）、 北 京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 東 株（AY536755） 和 廣 東 株（JX294717）的同源性在97.1%-96.0%之間，1號PCV2毒株與浙江株（AY188355）及山東株（AY536755）的同源性最高，達到97.9%。同源性最低的是北京株（AF381175），為96.0%。

圖2 PCV2基因核苷酸序列同源性比較

圖3 PCV2基因推導氨基酸同源性比較

圖4 PCV2推導氨基酸的遺傳進化樹（最大似然法）

圖5 PCV2推導氨基酸的遺傳進化樹（相似臨界法）

3號PCV2基因組與國外四株PCV基因組加拿大株（AF027217）、美國株（AY391927）、法國株（HM623764）和丹麥株（FJ935780）同源性分別為95.1%、96.0%、94.8%和 96.3%， 同源性相對較高且相差1.5%。在與國內6株PCV基因組浙江株（AY188355）（AY651850）、 北 京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 東 株（AY536755）和廣東株（JX294717）的同源性在98.4%～95.0%之間，1號PCV2毒株與南京株（AY556473）的同源性最高，達到98.4%。同源性最低的是北京株（AF381175），為95.0%。

1、2、3號的相互同源性比較相近，在97.7%～96.3%之間。

通過以上核苷酸同源性比較，可以看出，三株與國內基因組進行同源性比較與北京株（AF381175）同源性最低。浙江株（AY188355）（AY651850）的同源性比較相同，可以看出PCV2在進化上比較保守的這一特性。

2.2 PCV2基因推導氨基酸的生物信息學分析結果

PCV2均含有11個ORF區域，有2個主要即ORF1和ORF2。ORF1編碼復制酶相關的rep蛋白，ORF2編碼病毒的核衣殼蛋白。本試驗篩選PCV2基因的ORF1，獲得的核苷酸序列利用MEGA軟件推導出氨基酸序列，同時推導出上述NCBI數據庫里的十株PCV2基因的氨基酸序列，并利用DNA-start軟件進行同源性分析，得出以下結果。

1號PCV2基因組與國外四株PCV基因組加拿大株（AF027217）、美國株（AY391927）、法國株（HM623764）和丹麥株（FJ935780）同源性分別為91.3%、94.6%、89.6%和 94.7%， 同源性相對較高且相差5.1%。在與國內6株PCV基因組浙江株（AY188355）（AY651850）、 北 京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 東 株（AY536755） 和 廣 東 株（JX294717）的同源性在94.7%-91.9%之間，1號PCV2毒株與浙江株（AY188355）及山東株（AY536755）的同源性最高，達到94.7%。同源性最低的是南京株（AY556473），為91.9%。

2號PCV2基因組與國外四株PCV基因組加拿大株（AF027217）、美國株（AY391927）、法國株（HM623764）和丹麥株（FJ935780）同源性分別為90.0%、92.0%、89.3%和 92.2%， 同源性相對較高且相差2.9%。在與國內6株PCV基因組浙江株（AY188355）（AY651850）、北京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 東 株（AY536755）和廣東株（JX294717）的同源性在94.7%～90.0%之間，1號PCV2毒株與南京株（AY556473）的同源性最高，達到94.7%。同源性最低的是北京株（AF381175），為90.0%。

3號PCV2基因組與國外四株PCV基因組加拿大株（AF027217）、美國株（AY391927）、法國株（HM623764）和丹麥株（FJ935780）同源性分別為87.1%、89.8%、86.8%和 90.3%， 同源性相對較高且相差3.5%。在與國內6株PCV基因組浙江株（AY188355）（AY651850）、 北 京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 東 株（AY536755）和廣東株（JX294717）的同源性在96.4%～87.1%之間，1號PCV2毒株與南京株（AY556473）、的同源性最高，達到94.7%。同源性最低的是北京株（AF381175），為91.9%。

1、2、3號的相互同源性比較相近，在93.7%～90.3%之間。

通過以上核苷酸同源性比較，可以看出，三株推導出的氨基酸序列與南京株（AY556473）的同源性最高，與國外株法國株（HM623764）同源性最低，且都在90%以下。

2.3 PCV2基因推導氨基酸遺傳進化樹分析結果

將有核苷酸序列推導的氨基酸序列利用MEGA軟件分析，采用Poisson模型分別使用最大似然法和相似臨界法重復1 000次進行建樹分析，獲得下列進化樹。

在繪制的兩幅進化樹中可以看出，PCV2分成3個獨立的大群，1號PCV2基因組與2號、3號PCV2基因組不在一個大群，2號、3號PCV2基因組在一個大群。2號PCV2基因組和3號PCV2基因組在同一大群的不同亞組。并且2種不同的方法進行分析得出的分組情況一致，相互印證，說明進化樹穩定。

3 討論

目前通過已知病毒株的基因序列來擴增獲得流行株對應基因序列，并使用軟件分析核苷酸組成的DNA序列和蛋白質組成的氨基酸序列的同源性差異，來判斷目的基因的變異情況己經成為病毒基礎研究中重要且常用的手段和方法[8]。通過對流行株序列相關分析，監測流行株的變異情況及趨勢，提前做出預防措施對于生豬養殖有重要意義。

仔豬腹瀉情況多發，可由多種原因引起，通過對仔豬腹瀉病料中PCV2的檢測及生物信息學分析，可以看出PCV2在進化上相對比較保守，但隨著流行時間的增加也逐漸發生了變異，這些變異是否能導致毒力發生變化尚不明確。至今為止，雖然PCV2的研究已經取得了很大的進展，但是PCV2病毒的來源和致病機制尚不十分明確。并且當前不同國家和不同臨床病癥下分離到的PCV2毒株間的致病性有何差異也暫不清楚，對PCV2病毒的變異也處在探索階段。因此，對PCV2毒株基因組序列差異開展研究，有助于闡明疫病暴發的真正原因，從而控制疫病，減少損失。

本研究克隆的3株PCV2毒株，基因組大小均為1 767 bp，與本次實驗分析的其他PCV2毒株全基因組核苷酸序列同源性分型分別在在1#94.7%～89.6%、2#94.7%～89.3%、3#96.4%～86.8%之間，氨基酸序列同源性在1#97.9%～95.7%、2#97.1%～95.5%、3#98.4%～94.8%之間，說明三株PCV2 毒株與國內外已報道的PCV2分離株的相對同源性較高，PCV2毒株間的親緣關系很近，符合PCV2不同分離株間在遺傳上比較保守這一特性，同現階段對PCV2病毒的研究成果相印證。但是分析結果，也可以看出盡管遺傳保守，但也存在著變異，并且變異的發生同地理位置分布有一定程度上的相關性。

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四川省科技支撐計劃(2014NZ0043;2015NZ0072)

主要作者：平措，1975年，男，藏族，西藏林芝，中級獸醫師，動物檢疫專科，主要從事獸醫方向研究

2017-06-27）