濃香型高溫酒曲中蛋白酶產生菌的篩選與鑒定

黃家駟+劉盾+陳玄陽+王珊珊+陳燕+程爽

摘 要：該研究利用酪蛋白選擇性培養基從濃香型高溫酒曲中分離得到1株有明顯水解圈的蛋白酶產生菌LS-1，經16SrDNA鑒定其為地衣芽孢桿菌；LS-1通過發酵培養提取出粗酶液，其酶活為180U/mL。

關鍵詞：酒曲；蛋白酶；篩選；鑒定

中圖分類號 Q93-31 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）21-0029-03

Isolation and Identification of Protease-producing Srains from Luzhou-flavor Liquor Starter

Huang Jiasi1 et al.

（1School of Biological and Chemical Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，China）

Abstract：A protease-producing strain was isolated from Luzhou-flavor Liquor Starter with casein-selective medium，named LS-1. The 16SrDNA was amplified by PCR and the amplification products was subjected to sequencing and homology analysis. As a result，strain LS-1 was identified as Bacillus licheniformis. The protease activity in fermentation broth was 180U/mL.

Key words：Liquor Starter；Protease；Isolation；Identification

白酒是我國傳統的發酵食品，有著悠久的歷史，從古至今一直受到人們的喜歡。中國傳統白酒是以富含淀粉質的糧谷類為原料，以中國酒曲為糖化發酵劑，采用固態、半固態或液態發酵，經蒸餾、貯存和勾調而成的含酒精的飲料[1]，被列為世界著名六大蒸餾酒之一。因釀造原料、酒曲種類和生產工藝以及自然環境等因素的不同，形成了特色、風格不同的各種香型的白酒。釀造原料、酒曲種類和生產工藝以及自然環境等影響著白酒香型的形成。根據我國白酒的生產工藝可以看出，白酒釀造過程實質上是相關微生物的代謝過程，其微生物主要來源于酒曲、窖泥和酒醅，參與酒精及香味物質的形成，是影響典型香型形成的重要因素，釀酒微生物的種類、數量、分布及其消長變化等對白酒發酵途徑及最終產物的生成均有著重大的影響[2]。白酒生產中釀酒微生物的研究水平直接影響白酒生產技術水平，進而影響白酒的質量、微生物群落結構，尤其是風味微生物菌群結構，對于白酒的產量與質量起著決定性的作用[3-4]。

酒曲是微生物的培養物，是白酒生產中的糖化劑、發酵劑、產香劑，有“酒之骨”之稱。釀酒的糖化過程，是酒曲中蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶和果膠酶的協同作用的結果[5]。其中酒曲中的蛋白酶在釀酒過程中更是起到至關重要的作用。蛋白酶是分解蛋白質肽鍵一類水解酶的總稱。它能有效水解原料中的蛋白質，破壞原料顆粒間質細胞壁的結構，使原料中可利用的碳源增加；同時由于蛋白質的水解作用，提高了發酵料中氨基態氮的含量，促進酵母生長繁殖，加快發酵速率[6]。在白酒生產過程中不能忽視蛋白酶，從酒曲中選育出高產蛋白酶應用于釀酒工業，將極大改善酒曲性能，提高酒的質量和產率，縮短生產周期，降低生產成本。目前對于濃香型白酒釀酒微生物研究較多，主要集中在酒曲微生物產淀粉酶的菌株的研究，而對產蛋白酶菌株研究相對較少。為此，本文擬以河南本地濃香型白酒高溫酒曲為研究對象，對其中的可培養產蛋白酶微生物進行分離鑒定和產酶特性研究，從微生物的角度進一步理解白酒的發酵本質，以期從中獲得具有一定工業應用潛力的產酶菌株，為白酒生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酒曲 取自河南新境界酒業有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 （1）試劑：酪蛋白、牛肉膏、瓊脂粉等均為生物純，北京奧博星；葡萄糖、Na2HPO4·7H2O、 KH2PO4等均為分析純，天津科密歐；L-酪氨酸，分析純，sigma進口分裝；Folin-酚試劑：北京索萊寶；細菌DNA基因組提取試劑盒，北京天根；PCR及電泳所用試劑均購自Takara。（2）儀器：上海精宏DNP-9052電熱恒溫培養箱；國華SHA-C水浴振蕩器；上海安亭飛鴿TGL-16G高速臺式離心機；上海申安LDZX-50KBS高壓滅菌鍋；奧林巴斯CX23雙目光學顯微鏡；BioDrop超微量紫外可見分光光度計；Biometra T-Profssional Standard PCR儀；北京六一DYY-7C電泳儀；北京六一DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳槽；北京君意東方JY04S-3E凝膠成像分析儀；上海精科752N分光光度計。

1.1.3 培養基 （1）酪蛋白培養基[7]：Na2HPO4·7H2O 1.07g，KH2PO4 0.36g，酪蛋白4g，ZnCl2 0.014g，NaCl 1.2g，CaCl2 0.002g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4 0.02g，瓊脂20g，pH7.0，蒸餾水1000mL，121℃高壓滅菌。（2）種子培養基[8]：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，pH7.0，蒸餾水1000mL，121℃高壓滅菌。（3）發酵培養基[8]：葡萄糖40g，蛋白胨20g，Na2HPO4 1.4g，CaCl2 0.6g，MgSO4 0.4g，pH7.0，蒸餾水1000mL，121℃高壓滅菌。（4）營養瓊脂培養基：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，NaCl 5g，瓊脂20g，pH7.0，蒸餾水1000mL，121℃高壓滅菌。endprint

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 （1）樣品稀釋液的制備：準確稱取酒曲5g，研磨成粉，放入100mL的無菌生理鹽水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，震蕩至酒曲分散均勻后，即成10-1稀釋液，將其進行梯度稀釋，得到10-1～10-4稀釋度的稀釋液。（2）涂布平板法接種：用移液器依次吸取10-1～10-4樣品稀釋液200μL菌液至酪蛋白平板上，用涂布器將菌液在平板上涂布均勻。將涂抹好的平板平放于桌上20～30min后轉入37℃恒溫培養箱，倒置培養。

1.2.2 篩選及鑒定 37℃培養48h后，對各個稀釋度涂布平板進行觀察，選擇有較大透明圈的菌落利用劃線分離法進行二次純化；二次純化后挑取有透明圈的單菌落接種至營養瓊脂斜面上保存；挑取單菌落進行顯微鏡觀察，初步形態觀察后提取其基因組DNA進行16SrDNA的擴增，引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。將PCR產物送北京三博遠志生物技術有限公司進行測序，測序完成后將序列利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）Blast數據庫中進行16SrDNA相似性比較分析。

1.2.3 酶活測定 （1）粗酶液液制備：挑取將保存至斜面上的純培養物接種至發酵培養基，37℃搖床培養48h后離心取上清進行酶活測定。（2）酪氨酸標準曲線：L-酪氨酸標準液：按表1配制，L-酪氨酸稀釋液應在稀釋后立即進行測定。

分別取上述溶液各1mL，各加碳酸鈉溶液5mL、Folin-酚試劑溶液1mL，振蕩均勻，于40℃水浴中顯色20min，取出，用分光光度計于680nm，10mm比色皿，不含酪氨酸的0管為空白，分別測其吸光度，以吸光度A為縱坐標，酪氨酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線，利用回歸方程，計算當吸光度為1時的酪氨酸量（μg），即為吸光常數K值，K值應在95～100。

（3）酶活測定：采用Folin-酚法[9]對粗酶液進行酶活測定。酶活力單位定義：40℃下，每分鐘水解酪蛋白底物產生1μg酪氨酸，定義為為一個蛋白酶活力單位。將2%酪蛋白溶液放入40℃恒溫水浴中，預熱5min；取1mL粗酶液加入2mL預熱好的酪蛋白溶液中混勻后放入40℃水浴中保溫10min后加入1mL10%三氯乙酸終止反應，取1mL上清液加入0.55mol/LNa2CO35mL，加入1mLFolin-酚試劑至40℃水浴顯色20min后于680nm下測定吸光值，以加水的反應體系為空白。計算酶活：從標準去線上讀出最終稀釋液的酶活力，單位U/mL，原液的酶活力按照下式計算：蛋白酶的活力（U/mL）=A×K×4÷10×n。

式中：A：發酵原液的平行實驗的OD值；K：吸光常數；n：蛋白酶的液的稀釋倍數；4：反應試劑的總體積；10：反應時間10min；所得結果表示至整數

2 結果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

2.1.1 菌落平板形態 在37℃培養48h后，在分離培養基上可以觀察到有部分菌株周圍產生肉眼可見水解圈，其中水解圈較大的菌落呈白色，扁平，干燥，周圍呈雪花狀，見圖1。將該菌株命名為LS-1，對其進行革蘭氏染色，鏡檢呈紫色，短桿狀。

2.1.2 PCR產物擴增電泳分析 將菌株LS-1的16SrDNA產物進行瓊脂糖凝膠分析，條帶單一，約1.5kb（圖2）。

（泳道1為Maker：DL2000；泳道2為樣品）

2.1.3 16SrRNA序列分析及系統發育分析 LS-1 16SrRNA基因序列測序所獲得序列長度為1438bp，將其與Genebank數據庫中的序列進行同源性比對，發現LS-1與芽孢桿菌屬的16SrRNA基因序列自然聚類，LS-1的16SrRNA基因序列與9條相似性較高的序列利用MEGA7.0構建系統發育樹見圖3，從圖3中可看出，LS-1與Bacillus licheniformis strain AS-08E（GenBank：JN118574.1）聚為一群，相似性也最高，表明LS-1與Bacillus licheniformis strain AS-08E的親緣關系最近。

2.2 LS-1酶活測定 根據圖4可知，LS-1菌株粗酶液的酶活為180U/mL。與文獻中其它酒曲源的蛋白酶產生菌相比，LS-1的蛋白酶活力一般，可能是未對其產酶條件進行進一步的優化研究。王麗等[10]從汾酒曲醅中篩選到一株高溫蛋白酶芽孢桿菌W20，其在55℃時最高酶活為708.33U/mL。王俊英等[11]從宋河酒曲中分離到一株產蛋白酶芽孢桿菌M4，其最適酶活力溫度為40℃，在此條件下酶活為366U/mL。

3 討論

酒曲中微生物種類豐富，本文僅從樣品中分離到一株產蛋白酶菌株LS-1，推測該菌株為酒曲中的優勢菌，也可能是樣品處理過程中未進行富集培養。目前已報道的高溫產蛋白酶菌種來源多為枯草芽孢桿菌、嗜熱芽孢桿菌和脂肪芽孢桿菌，分離生境比較豐富，多為溫泉、酒醅等環境。本文中篩選到的菌株LS-1為酒曲中篩選獲得，在今后工作中將對其發酵條件和酶學性質進行深入研究，以期為該蛋白酶在食品、釀酒工業中的應用提供理論依據。

參考文獻

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[3]徐穎宣，徐爾尼，馮乃憲，等.微生物混菌發酵應用研究進展[J].中國釀造，2008（9）：1-4.

[4]范光先，王和玉，崔同弼，等.茅臺酒生產過程中的微生物研究進展[J].釀酒科技，2006（10）：75-77.

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[9]張彩瑩，肖連冬.生物化學實驗[M].北京：化學工業出版社，2009：10-67.

（責編：張宏民）endprint