EP2A體外可促進人CD34+細胞歸巢而不能促進其增殖*

劉芳潔， 汪亞群， 唐 晶， 陳惠珍， 賴淑萍， 蘇 暢， 李 娟， 許多榮

(中山大學附屬第一醫院血液科， 廣東 廣州 510080)

EP2A體外可促進人CD34+細胞歸巢而不能促進其增殖*

劉芳潔， 汪亞群， 唐 晶， 陳惠珍， 賴淑萍， 蘇 暢， 李 娟， 許多榮△

(中山大學附屬第一醫院血液科， 廣東 廣州 510080)

目的探討前列腺素E2受體2激動劑(EP2A)在體外對人CD34+細胞的歸巢與增殖作用。方法收集健康供者經粒細胞集落刺激因子動員后的外周血，免疫磁珠法分選出人CD34+細胞；同時收集健康供者動員前骨髓液，分離單個核細胞，并行骨髓間充質干細胞(BMMSC)培養。人CD34+細胞和BMMSC經前列腺素E2(陽性對照)、DMSO(陰性對照)、EP2A和EP2A+前列腺素E2受體2拮抗劑(EP2AA)處理后，對人CD34+細胞用CCK-8法檢測細胞活力，集落形成實驗檢測集落形成數目，流式細胞術檢測G2/M期細胞比例，Western blot檢測細胞中survivin、β-catenin及CXC趨化因子受體4(CXCR4)的蛋白表達；ELISA法檢測BMMSC中基質細胞衍生因子1α(SDF-1α)的含量。結果EP2A組與陰性對照組相比，人CD34+細胞在細胞活力、集落形成數目、G2/M期比例及survivin和β-catenin蛋白表達方面均無明顯差別。但EP2A組人CD34+細胞CXCR4及BMMSC SDF-1α的表達均明顯高于陰性對照組。結論EP2A體外可促進人CD34+細胞歸巢但不能促進其增殖。

前列腺素E2； 前列腺素E2受體2激動劑； 細胞增殖； 歸巢

異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HSCT)是目前能夠治愈惡性血液病的一種重要手段，促使造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSC)增殖和歸巢是使得HSC植入成功的關鍵[1]。目前關于促進HSC歸巢的機制已經研究得比較透徹，相關研究明確指出促進HSC歸巢的關鍵在于CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)/基質細胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α)信號軸[2-4]。Goichberg 等[5]報道前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)可以通過上調小鼠HSC表面的CXCR4表達，增加其對SDF-1α的趨化作用，進而達到促進HSC歸巢的作用，而對于促進HSC增殖的具體機制尚未完全明了。本課題組前期研究已經證實，PGE2可促進人CD34+細胞體外增殖和歸巢，這一點同早期國外的研究保持一致[6]；同時也證實了人CD34+細胞均能表達PGE2的4個特異性受體，即PGE2受體1～4(prostaglandin E2receptors 1～4, EP1～EP4)，但以EP2和EP4受體為主。本課題組還發現，EP1和EP3受體在人CD34+細胞中不起作用，主要是通過EP2和EP4受體發揮作用。PGE2受體2激動劑(EP2agonist， EP2A)是否能通過活化EP2受體同時發揮促進人CD34+細胞歸巢與增殖的作用仍需進一步探討。本研究旨在探討EP2A是否能同時促進人CD34+細胞體外歸巢和增殖，從而為研發促進HSC成功植入的藥物提供理論依據。

材 料 和 方 法

1試劑

經健康供者同意，收集本院2015年8月～2016年8月期間健康供者經粒細胞集落刺激因子動員后的外周血采集產物及動員前骨髓液；PGE2和PGE2受體2拮抗劑(EP2antagonist， EP2AA)購于Cayman；EP2A由Ono Pharmaceutical Co. Ltd饋贈；人淋巴細胞分離液(Ficoll-Paque)購于MP Biomedicals；無血清培養基StemSpan TM SFEM購于Stem Cell Technologies；CD34+免疫磁珠試劑盒購于MiltenyiBiotec；甲基纖維素購于Sigma；重組人干細胞因子(recombinant human stem cell factor， rhSCF)、rhFlt3、rhTPO和rhIL-3購于Peprotech；CCK-8試劑盒購于日本同仁公司；DMEM/F12培養基購于Thermo Fisher；抗survivin和β-catenin抗體購于CST；抗CXCR4抗體購于Santa-cruze；SDF-1α ELISA試劑盒購于R&D。

2主要方法

2.1人CD34+細胞磁珠分選及流式鑒定 具體見參考文獻[7]。

2.2骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSC)培養和鑒定 用人淋巴細胞分離液分離骨髓單個核細胞，用DMEM/F12+10% FBS 重懸，接種至10 cm皿中貼壁培養，約4～5 d后換液，繼續培養，待細胞匯合至90%時，胰酶消化傳代。取第3代生長狀態良好的細胞，以流式細胞術檢測表面抗原CD73、CD90、CD105、CD14、CD34和CD45的表達。

2.3人CD34+細胞和BMMSC的藥物處理 將分選后的人CD34+細胞及生長狀態良好的第3代BMMSC用培養基重懸至5×108/L；人CD34+細胞培養基中加入細胞因子rhSCF、rhFlt3、rhTPO(終濃度為100 μg/L)和rhIL-3(終濃度為20 μg/L)，將其分成4組：PGE2(陽性對照)組、DMSO(陰性對照)組、EP2A(0.1 μmol/L)組和EP2A+EP2AA(濃度同EP2A)組，然后放入37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中繼續培養24 h。收集細胞用于后續實驗。

2.4CCK8法檢測藥物處理后人CD34+細胞的細胞活力 將收集的細胞以每孔100 μL接種于96孔板，EP2A終濃度分別設置0、0.1、0.5、1、5和10 μmol/L，每組設3個平行孔，冰上培養2 h后，繼續在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中分別培養22 h、46 h、70 h和94 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，輕輕混勻，置于37℃、5% CO2培養箱中培養4 h，在450 nm波長處用酶標儀測吸光度值(A值)。另設立4個組： PGE2(終濃度1 μmol/L)組、DMSO(<0.1%，陰性對照)組、EP2A(1 μmol/L)組和EP2A+EP2AA(濃度同EP2A)組，冰上培養2 h，培養箱中培養22 h，其余操作同上。細胞活力(%)=A實驗組/A空白組×100%。

2.5集落形成實驗 具體見參考文獻[7]，2周后倒置顯微鏡下識別和計數集落形成。

2.6流式細胞術測定細胞周期 取方法2.3中收集的細胞離心棄上清，PBS洗滌后70%冰乙醇-20 ℃固定過夜，PBS洗滌后加入RNase-A和碘化丙啶避光染色30 min，流式細胞儀分析細胞周期分布，具體見參考文獻[7-8]。

2.7人CD34+細胞中survivin、β-catenin和CXCR4蛋白的表達情況 取方法2.3中收集的細胞，提取蛋白，具體見參考文獻[7]。

2.8ELISA法檢測BMMSC分泌的SDF-1α水平 按ELISA試劑盒操作說明檢測各組細胞分泌的SDF-1α水平。

3統計學處理

所有數據分析采用統計軟件SPSS 24.0。數據方差齊采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1人CD34+細胞的分選與鑒定

人外周血采集產物經CD34+磁珠分選后，用流式細胞儀鑒定分選細胞的純度，結果顯示CD34+細胞純度達90%以上。

2BMMSC的培養及鑒定

對分離的骨髓單個核細胞進行培養，1周后于倒置顯微鏡下可觀察到呈漩渦狀生長的長梭形、紡錘形和多角形細胞，后通過換液和傳代對其進行純化培養。流式細胞術檢測發現，細胞表面高表達CD73、CD90和CD105抗原，而不表達CD14、CD34和CD45抗原，說明這群細胞是BMMSC。

3EP2A對人CD34+細胞的時間和濃度效應

采用CCK-8法檢測不同濃度的EP2A作用不同時間后CD34+細胞活力的變化，結果顯示，相同培養時間下，EP2A濃度在0～10 μmol/L之間時，人CD34+細胞活力沒有明顯變化；而相同EP2A濃度下，在培養時間為24～96 h之間，EP2A對人CD34+細胞活力的作用也無明顯變化。另外，PGE2組的細胞活力是陰性對照組的1.40倍(P<0.05)，EP2A組和陰性對照組間無明顯差異。這說明EP2A對促進人CD34+細胞生長無明顯作用，見圖1。

Figure 1. The viability of human CD34+cells detected by CCK-8 assay. A: theAvalue of human CD34+cells treated with different doses of EP2A for different time; B: the viability of human CD34+cells using the control group as 100%.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1CCK-8法檢測人CD34+細胞的活力變化

4EP2A對人CD34+細胞集落形成影響

造血祖細胞由造血干細胞分化而來，它的增殖能力需要依靠造血干細胞增殖來補充，因此集落形成實驗可以通過反映造血祖細胞的增殖能力，間接反映造血干細胞的分化能力。本研究采用集落形成實驗檢測人CD34+細胞的增殖能力，經處理后的人CD34+細胞用甲基纖維素半固體培養基培養2周，倒置顯微鏡下識別和計數各系集落，結果示EP2A對各系集落形成與陰性對照組的差異無統計學顯著性，見圖2。

5EP2A對人CD34+細胞的細胞周期分布的影響

采用流式細胞術檢測各處理組人CD34+細胞，結果發現PGE2組處于G0/G1期的細胞比例為(79.97±1.71)%，較陰性對照組(85.37±2.25)%下降，差異具有統計學意義(P<0.05)，EP2A組處于G0/G1期的細胞比例(85.83±2.48)%，較陰性對照組無明顯差別；各藥物處理組處于S期的細胞比例與陰性對照組比較差異無統計學顯著性；PGE2組處于G2/M期的細胞比例為(11.80±0.87)%，較陰性對照組(6.67±0.71)%明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.01)，EP2A組處于G2/M期的細胞比例較陰性對照組無明顯差異。由此可知，EP2A不能促進人CD34+細胞由靜止期進入細胞周期，見圖3、表1。

6EP2A對人CD34+細胞中survivin、β-catenin及CXCR4蛋白表達的影響

采用Western blot方法檢測經處理后人CD34+細胞中survivin、β-catenin及CXCR4蛋白的表達變化情況。結果發現經EP2A干預后，survivin和β-catenin蛋白表達量與陰性對照組比較差異無統計學顯著性，而CXCR4蛋白的表達量是陰性對照組的1.65倍(P<0.05)，且能被相應拮抗劑所抑制(P<0.05)。以上結果顯示，EP2A能促進趨化因子受體CXCR4蛋白表達，不能促進survivin、β-catenin 蛋白表達，見圖4。

Figure 2. The changes of colony-forming units (CFU) in the human CD34+cells with different treatments (×10). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2不同藥物處理對各集落形成的影響

7EP2A促進BMMSC分泌趨化因子SDF-1α

采用ELISA法檢測經處理后BMMSC中SDF-1α的蛋白分泌水平。結果顯示EP2A組中BMMSC分泌的SDF-1α 蛋白量是陰性對照組的1.51倍，加入相應拮抗劑后，蛋白表達明顯下降，見圖5。

討 論

早在20世紀Fehér 等[9]就首次報道了PGE2能增加小鼠骨髓細胞的集落形成，其后North 等[10]發現，runx1/cmyb蛋白在經PGE2處理的斑馬魚胚胎造血祖細胞中表達增加。目前的研究均證實PGE2在促進移植后的HSC歸巢和防止其植入功能不良方面具有巨大的臨床應用前景[11]。本課題組前期研究已證實PGE2具有促進人CD34+增殖和歸巢的作用，本研究擬進一步明確EP2A是否能通過EP2受體既發揮促進人CD34+歸巢作用又發揮促進人CD34+增殖作用。

經EP2A處理后，隨著作用時間延長和藥物濃度的升高，人CD34+細胞活力并沒有明顯增加，說明EP2A對人CD34+細胞生長作用不明顯。正常生理情況下，人HSC大部分處于靜止期，本研究檢測，經EP2A處理后，人CD34+細胞處于G0/G1期的比例為(85.83±2.48)%，與陰性對照組相比差異無統計學顯著性；處于G2/M期的細胞比例亦無明顯變化，這表明PGE2不通過EP2受體促進HSC進入細胞周期。Baba等[12]和Fukuda 等[13]研究表明PGE2可以通過刺激抗凋亡蛋白survivin的表達來促進人CD34+進入細胞周期。本研究發現，經EP2A處理后，人CD34+細胞中survivin在蛋白表達較陰性對照組無明顯增加，因此無法實現促使HSC由靜止期進入細胞周期。β-catenin是調控細胞增殖的Wnt經典信號途徑的經典因子，EP2A組中β-catenin的蛋白表達較陰性對照組沒有明顯變化。以上結果均表明EP2A對促進HSC增殖沒有明顯作用。

Figure 3. The changes of the cell cycle distribution in the human CD34+cells with different treatments.

圖3不同藥物處理后CD34+細胞周期的分布情況

表1經不同方式處理后細胞具體周期分布情況

Table 1. The cell cycle distribution of human CD34+cells with different treatments (Mean±SD.n=3)

Group G0/G1SG2/MControl85．37±2．257．96±1．666．67±0．71PGE279．97±1．71?8．23±0．9711．80±0．87?EP2A85．83±2．487．70±1．236．47±1．90EP2A+EP2AA86．03±3．207．50±1．236．47±2．39

*P<0.05vscontrol group.

Figure 4. The protein expression of survivin (A), β-catenin (B) and CXCR4 (C) in the human CD34+cells with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsEP2A group.

圖4不同藥物處理后人CD34+細胞中survivin、β-catenin和CXCR4的表達情況

Figure 5. The secretion of SDF-1α in the BMMSCs with different treatments detected by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5不同藥物處理后BMMSC中SDF-1α的分泌情況

CXCR4/SDF-1α信號軸在HSC歸巢過程中起著關鍵作用。趨化因子受體CXCR4表達于HSC表面。本實驗觀察到，與PGE2效應相似，經EP2A處理后人CD34+表面蛋白CXCR4表達增加，而當加入其對應的受體拮抗劑EP2AA后，CXCR4的表達水平明顯下降。基質細胞衍生因子SDF-1α主要由骨髓基質細胞合成并分泌，為HSC的體內遷移提供定向動力。當BMMSC經PGE2和EP2A處理后，其合成與分泌的SDF-1α明顯升高，當EP2A組加入其對應的受體拮抗劑EP2AA后，SDF-1α的合成與分泌明顯減少。

綜上所述，我們認為EP2A可促進人CD34+體外歸巢，不能促進其增殖，即PGE2不能通過EP2受體促進人CD34+細胞體外增殖。而對于PGE2促進增殖的具體機制以及通過哪一條信號途徑促進人CD34+細胞增殖，本課題組正在進一步研究。

[1] Servais S, Beguin Y, Baron F. Emerging drugs for prevention of graft failure after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation[J]. Expert Opin Emerg Drugs, 2013,18(2):173-192.

[2] Kim M, Kim DI, Kim EK, et al. CXCR4 overexpression in human adipose tissue-derived stem cells improves homing and engraftment in an animal limb ischemia model[J]. Cell Transplant, 2017, 26(2):191-204.

[3] Larochelle A, Gillette JM, Desmond R, et al. Bone marrow homing and engraftment of human hematopoietic stem and progenitor cells is mediated by a polarized membrane domain[J]. Blood, 2012, 119(8):1848-1855.

[4] Asri A, Sabour J, Atashi A, et al. Homing in hemato-poietic stem cells: focus on regulatory role of CXCR7 on SDF1a/CXCR4 axis[J]. EXCLI J, 2016, 15:134-143.

[5] Goichberg P， Kalinkovich A， Borodovsky N， et al. cAMP-induced PKCζ activation increases functional CXCR4 expression on human CD34+hematopoietic progenitors[J]. Blood, 2006, 107(3):870-879.

[6] Durand EM, Zon LI. Newly emerging roles for prostaglandin E2regulation of hematopoiesis and hematopoietic stem cell engraftment[J]. Curr Opin Hematol, 2010, 17(4):308-312.

[7] 賴淑萍， 戚永磊， 許多榮. 前列腺素E2體外可促進人CD34+細胞增殖[J]. 中山大學學報： 醫學科學版, 2013， 34(1):22-27.

[8] 秦瑞英， 夏永華， 任艷芳， 等. AEG-1表達下調對人宮頸癌細胞細胞周期和侵襲能力的影響及其機制[J]. 中國病理生理雜志, 2013， 29(6):1020-1024.

[9] Fehér I， Gidáli J. Prostaglandin E2as stimulator of hematopoietic stem cell proliferation[J]. Nature,1974, 247(442):550-551.

[10] North TE, Goessling W, Walkley CR, et al. Prostaglandin E2regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis[J]. Nature, 2007, 447(7147):1007-1011.

[11] Hoggatt J, Pelus LM. Eicosanoid regulation of hematopoiesis and hematopoietic stem and progenitor trafficking[J]. Leukemia, 2010, 24(12):1993-2002.

[12] Baba HA, Wohlschlaeger J, Schmitz KJ, et al. Survivin is upregulated during liver regeneration in rats and humans and is associated with hepatocyte proliferation[J]. Liver Int, 2009, 29(4):585-592.

[13] Fukuda S, Foster RG, Porter SB, et al. The antiapoptosis protein survivin is associated with cell cycle entry of normal cord blood CD34+cells and modulates cell cycle and proliferation of mouse hematopoietic progenitor cells[J]. Blood, 2002, 100(7):2463-2471.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

EP2A promotes human CD34+cell homing in vitro but not proliferation

LIU Fang-jie, WANG Ya-qun, TANG Jing, CHEN Hui-zhen, LAI Shu-ping, SU Chang, LI Juan, XU Duo-rong

(DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:xudr@hotmail.com)

AIM: To investigate the role of prostaglandin E2receptor 2 agonist (EP2A) in proliferation and homing of human CD34+cells.METHODSBone marrow fluid and peripheral blood containing stem cells were collected from healthy donors mobilized by granulocyte colony-stimulating factor in our department. Human CD34+cells were isolated by the method of magnetic-activated cell sorting microbeads. Bone marrow mononuclear cells were isolated by Ficoll-Paque centrifugation, and the bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) were cultured with L-DMEM. Human CD34+cells and BMMSC were divided into 4 groups, and treated with PGE2(as positive control), DMSO (as negative control), EP2A and EP2A+prostaglandin E2receptor 2 antagonist (EP2AA)， respectively. After exposed to the reagents, human CD34+cell viability was measured by CCK-8 assay, the number of colonies was evaluated by colony-formation assay, the cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry, and the protein expression of survivin, β-catenin and CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) was detrmined by Western blot. Moreover, the concentration of stromal cell-derived factor-1α (SDF-1α) in the BMMSC was detected by ELISA.RESULTSThe cell viability and the colony number of human CD34+cells in EP2A group were not higher than those in negative control group. Furthermore, the proportion of human CD34+cells treated with EP2A in G2/M phase was not elevated compared with negative control group. The protein expression of survivin and β-catenin did not up-regulated in human CD34+cells exposed to EP2A, but the protein expression of CXCR4 in human CD34+cells and the concentration of SDF-1α in BMMSC were elevated.CONCLUSIONEP2A promotes human CD34+cell hominginvitrobut not proliferation.

Prostaglandin E2; Prostaglandin E2receptor 2 agonist; Cell proliferation; Homing

1000- 4718(2017)11- 2026- 06

2017- 04- 28

2017- 07- 17

國家自然科學基金資助項目(N0. 81370663)

△通訊作者 Tel: 020-87755766-8911； E-mail: xudr@hotmail.com

R551.3； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.017