冬鳳蘭組織培養與快繁技術研究

董曉娜++徐佩玲++陳培++杜麗敏

摘 要 通過探索冬鳳蘭的組培技術，為冬鳳蘭的保護和工廠化生產提供技術支撐。以冬鳳蘭蒴果為原材料，通過不同激素對比，篩選適宜萌芽培養基，并開展了冬鳳蘭增殖擴繁、生根壯苗、移栽馴化等一系列研究。結果表明：在培養基MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+CM 15%上，萌發時間最早，萌芽率較高；在改良VW培養基上芽分化效果較MS培養基好，芽分化率高，生長勢好；在生根培養基VW+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+卡拉膠10 g/L+活性炭0.4 g/L上，生根率達100%；冬鳳蘭后期需要采用630或650 mL的組培瓶。

關鍵詞 冬鳳蘭 ；VW培養基 ；組織培養 ；快速繁殖

中圖分類號 S682.31 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.10.012

Tissue Culture and Rapid Propagation of Cymbidium dayanum

DONG Xiaona XU Peiling CHEN Pei DU Limin

（Forestry Research Institute of Hainan Province， Haikou， Hainan 571100）

Abstract Tissue culture was conducted to provide technical support to conservation and mass production of Cymbidium dayanum. Capsules of C. dayanum were used as material and cultured for plant regeneration. Different hormones were tried in the MS mediums to select a suitable germination medium. The germinated capsules were then cultured for proliferation， rooting， formation of strong rooted plantlets and transfer. The results showed that the capsule germinated the earliest with the highest germination rate when cultured in the MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+CM 15% medium， that the bud differentiation was higher in the improved VW medium than in the MS， with higher growth vigor， that the rooting rate was 100% when the plantlets were cultured in the rooting medium VW+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+carrageenan10 g/L+0.4 g/L， and that the rooted plantlets were then transferred into tissue culture bottles with the bottle size of 630/650 mL.

Keywords Cymbidium dayanum ； VW medium ； tissue culture ； rapid propagation

冬鳳蘭（Cymbidium dayanum Rchb. f.）為附生蘭，生于海拔300～1 600 m的疏林中樹上或沿溪谷旁巖石壁上。海南主要產地為陵水、瓊中、白沙等地。冬鳳蘭總狀花序具5～9朵花；花葶側生，下垂或外彎；萼片和花瓣白色至奶油黃色，中央有1條粟褐色縱帶（從基部到上部3/4處），或偶見整個瓣片充滿淡棗紅色，唇瓣栗色，但褶片和中央裂片為白色；冬鳳蘭花期為8～12月份[1]。冬鳳蘭花期持久，株型優美，具有極大的觀賞價值。羅遠華等[2]采用灼燒法對冬鳳蘭蒴果進行滅菌處理，認為此法不用殺菌劑且操作簡便，是冬鳳蘭種子理想的滅菌方法。林泋君[3]以澳大利亞進口的冬鳳蘭花梗中部為外植體進行試管繁殖。目前針對冬鳳蘭的研究相對較少。本研究通過常規升汞消毒的方法處理蒴果，將種子無菌播種于MS培養基，通過不同激素誘導出原球莖或芽后，采用改良VW和MS 2種培養基進行原球莖或芽的分化培養，并以改良VW培養基為基礎培養基開展擴繁、生根培養研究，探索冬鳳蘭的組織培養技術，為其工廠化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

冬鳳蘭的蒴果來源于海南省林業科學研究所野生蘭花種質資源圃內。試驗在海南省林業科學研究所生物技術研究室進行。以八九成熟的自交蒴果為供試材料，從蒴果中收集種子作為外植體進行種子的無菌播種。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

取八九成熟的尚未裂開的蒴果為外植體；在超凈工作臺上，切除蒴果的果梗，用75%酒精棉球擦去表面的臟物后，將其浸泡在75%酒精中30 s，然后用無菌水沖洗2～3次后，再用0.1%升汞溶液消毒15 min，并不時振蕩，最后用無菌水沖洗5～6次，每次5 min；將消毒好的蒴果放于無菌接種盤中，用消毒刀將蒴果切開后即可播種。

1.2.2 種子萌發培養

以MS為種子萌發的基本培養基，分別添加6-BA（0.5、1.0 mg/L）+NAA 0.5 mg/L組合，并添加白糖30 g/L、卡拉膠10 g/L，CM 15%，具體見表1，pH 5.7。endprint

1.2.3 原球莖增殖

誘導出原球莖或芽后，為在短時間內獲得大量組培材料，本研究采用液體振蕩的方式。增值培養基為改良VW培養基，添加6-BA 1.0 mg/L，并附加白糖30 g/L，活性碳0.4 g/L，pH 5.7。增殖率采用稱量法進行統計，增殖率=（接入原球莖振蕩培養20 d后組培瓶重-接入原球莖初組培瓶重）×100%。

1.2.4 原球莖分化

分別采用MS和改良VW 兩種基本培養基，添加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L，并附加白糖30 g/L、卡拉膠10 g/L、活性炭0.4 g/L，調節pH為5.7，對原球莖進行分化培養。每處理接種10瓶，3個重復，培養40 d后統計原球莖的分化率。原球莖分化率=（分化出莖葉的原球莖數/接種原球莖數）×100%。

1.2.5 生根培養及移栽

將分化出莖葉的原球莖切去單芽后接種于壯苗生根培養基VW+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+卡拉膠10 g/L+活性炭0.4 g/L中進行生根誘導。

后期將組培苗移入630 或650 mL的組培瓶中，待苗高10～11 cm、葉3～5片、根數3～6時即可移栽。移栽前首先要將組培瓶移入蘭花棚中不開蓋煉苗15～30 d后，再開蓋煉苗至少3 d；煉苗后將苗取出，洗凈根上的培養基，用多菌靈溶液浸泡消毒并晾干，移栽入組培盤內。

1.2.6 培養方式及培養條件

采用固體培養基培養的方式，早期以220 mL的組培瓶為培養容器，每瓶培養基用量為30～40 mL；后期采用630或650 mL的組培瓶為培養容器，每瓶培養基用量為100 mL左右，pH值5.7。除種子無菌播種時需要暗室培養外，其余培養條件基本一致。培養溫度為（26±2）℃，以日光燈為光源，每天光照時間為12 h（早上8點至晚上8點），光照強度為1 500～2 000 lx。

2 結果與分析

2.1 不同培養基激素組合對種子萌發情況的影響

將消毒好的種子分別播種在1～4號誘導培養基上（表1），觀察種子萌發情況。結果表明，冬鳳蘭種子無菌播種大約3～4個月后陸續有芽點出現，隨著培養時間的延長球狀凸起不斷伸長，形成原球莖或芽（圖1-A、圖1-B）。從表1可看出，采用不同培養基配方，種子的萌芽時間略有不同。當6-BA濃度為1.0 mg/L時，萌發時間相對0.5 mg/L早，添加CM后萌發時間略有縮短。試驗結果表明，6-BA對原球莖芽的誘導起主導作用，而且在添加了CM的培養基上萌發時間會縮短。

2.2 原球莖的增殖培養

冬鳳蘭的增殖培養采用液體振蕩的方式。在100 r/min的轉速下振蕩培養20 d，切除芽點后的原球莖能快速增殖，增殖率采用稱量法進行統計，結果顯示增殖率為132.00%。

2.3 不同培養基對冬鳳蘭原球莖分化培養的影響

將原球莖接種在MS、VW 2種培養基上進行分化培養，芽分化效果略有不同（表2）。在VW培養基上芽分化速度較MS培養基快，且芽分化率高，生長勢好；此外，在VW培養基上時，冬鳳蘭的根也開始分化。

2.4 壯苗生根培養

冬鳳蘭易生根，在分化培養基中，冬鳳蘭即有根生成，但是如果添加激素IBA，根長勢更好。壯苗生根50 d左右，即可形成健壯的完整植株，生根率達100%。

2.5 組培苗移栽

本研究中先后采用了220 和630或650 mL規格的組培瓶進行試驗（圖2）。在220 mL的組培瓶中，待冬鳳蘭成苗后轉入生根培養基，轉接后1個月左右，苗即頂蓋，此時苗還幼嫩，不粗壯，若直接煉苗移栽，成活率低于80%；如果再次轉接該規格瓶，因為苗高已頂瓶蓋，轉接的污染率也較高，此外，當轉接不及時、接種苗數多時，會導致根部環繞，如圖3所示。如果成苗后轉入220 mL組培瓶中，待苗快頂蓋時轉入630或650 mL的組培瓶中進行壯苗培養，這樣冬鳳蘭組培苗在瓶內可多生長半個多月，此時莖部較粗壯，因此移栽成活率更高，可達95%以上。

待冬鳳蘭組培苗長至瓶頸口，高約10 cm時，轉移至大棚的自然光下煉苗15～30 d后，再開蓋煉苗3～5 d；將組培苗取出洗凈培養基，用多菌靈浸泡后晾干根部，先用浸泡過的水草包裹根部并移栽入組培盤內。根據前幾日的水草濕潤度和天氣，可暫時不澆水，當水草干透后淋水。待組培苗移栽成活后，可移入含火山石/椰糠+松樹皮的混合基質中，保持適當通風和足夠濕度，成活率可達到95%左右。

3 討論

無菌播種是蘭科植物種子萌發的主要方法，目前多采用MS培養基對冬鳳蘭進行無菌播種、組織培養研究。本研究利用常規的升汞消毒蒴果的方法，將冬鳳蘭種子無菌播種于含6-BA+NAA的誘導培養基上，經暗室培養后萌發出白色原球莖，見光后轉綠。其中在 MS+6-BA 1.0 g/L+NAA 0.5 g/L+CM 15%的培養基上時，誘導率較高。羅遠華等[2]研究表明，冬鳳蘭種子在花寶1號或MS培養基上培養90 d后萌芽率達98%以上，可添加適量的CM，低濃度的6-BA和NAA有利于冬鳳蘭種子形成原球莖，這與本研究結論一致。不過羅遠華等[2]采用的外植體處理方式為灼燒法，并認為此法無需殺菌劑且操作簡便，是冬鳳蘭種子理想的滅菌方法。

為了大量增殖原球莖，本研究采用液體振蕩的方式。將原球莖接種入VW液體培養基，添加6-BA 1.0 mg/L，并附加白糖30 g/L、活性炭0.4 g/L，pH 5.7。振蕩培養20 d后，增殖率為132.00%。

本研究中，將原球莖分別轉接入VW和MS 2種分化培養基。在VW培養基中，冬鳳蘭原球莖分化出芽、根的速度快，分化率高，而且組培苗莖粗，葉片綠。

在研究過程中，一般使用傳統的220 mL規格的組培瓶，但是冬鳳蘭生長速度快，葉細長，如果一直采用此規格的瓶，轉接的污染率較高，而且當轉接不及時、接種苗數多時，會導致根部環繞。后期煉苗移栽時不能形成單株，如果有一株染病或根部腐爛會導致整瓶十余株感染。因此，冬鳳蘭在壯苗生根階段應采用630或650 mL規格的組培瓶，可增加其在瓶內生長時間，提高后期瓶苗移栽成活率。

參考文獻

[1] 丁慎言，尹俊梅. 海南島野生蘭花圖鑒（第1版）[M]. 北京：中國農業出版社，2015.

[2] 羅遠華，冷青云，莫 饒，等. 冬鳳蘭非共生萌發和低溫離體保存[J]. 安徽農業科學，2008，36（9）：8 068-8 069.

[3] 林泋君. 冬鳳蘭工廠化快速繁殖和移栽技術研究[J]. 北方園藝，2011（12）：116-117.

[4] 葉秀仙，黃敏玲，林榕燕，等. 素心建蘭無菌播種快繁技術研究[J]. 福建農業學報，2015，30（10）： 939-943.

[5] 陳 春. 建蘭‘嶺南奇蝶種子無菌萌發與立體繁殖技術[J]. 亞熱帶農業研究，2016，12（2）：125-129.endprint