人乳鐵蛋白的沙漠小球藻表達系統的構建與鑒定

牟云+汪文倫+許萬云+胡夢薇+王丹+嚴國+王會敏+高劍峰

摘要：為獲得人乳鐵蛋白的沙漠小球藻（Chlorella sp. GTD8A1）的表達系統和穩定的小球藻GTD8A1-hLF工程藻種，將人乳鐵蛋白基因導入小球藻細胞中進行表達鑒定。以人血cDNA為模板，RT-PCR擴增得到人乳鐵蛋白基因（GenBank登錄號NM-002343.4），經KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切后，連接到植物表達載體pCAMBIA2300-35S-OCS中，獲得重組質粒載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS，將重組質粒電擊轉入GTD8A1中，通過菌落PCR鑒定后擴大培養，在DNA和RNA水平分析人乳鐵蛋白基因的整合和轉錄，SDS-PAGE和Western Blot分析獲得70 ku的目的蛋白；將轉基因藻種（GTD8A1-hLF）在BBM培養基中進行培養周期優化。結果表明，重組人乳鐵蛋白在沙漠小球藻細胞中表達成功；通過Elisa測其人乳鐵蛋白表達量在20 d時達到最大，濃度為13.28 mg/L。

關鍵詞：小球藻；人乳鐵蛋白；表達系統；SDS-PAGE；Western Blot；構建；鑒定

中圖分類號： S188 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）19-0138-05

收稿日期：2016-05-06

基金項目：國家自然科學基金（編號：31460276）。

作者簡介：牟 云（1992—），女，四川華鎣人，碩士研究生，從事可再生能源的開發與利用相關研究。E-mail：1171534413@qq.com。

通信作者：高劍峰，教授。E-mail：jianfengg@shzu.edu.cn。 新疆古爾班通古特沙漠位于準噶爾盆地的中央，是我國第二大沙漠和面積最大的固定、半固定沙漠。年降水量70～150 mm，冬季有積雪，春季和初夏降水略多，冬季最低地表溫度可達-25 ℃，夏季最高地表溫度可達30 ℃[1]。生長在此的小球藻及其他藻類與高等植物經過百萬年的進化，已經完全適應了沙漠的極端環境。從20世紀80年代末開始，對沙漠微藻的研究與開發受到國內外研究者的重視[2]。研究表明，在新疆沙漠中生長著百余種藻類，小球藻是其中重要的組成部分[3]。小球藻為球形或橢圓形綠色單細胞藻類植物，也是真核微生物的一種。其細胞直徑3～8 μm，是地球上最早的生命之一，出現在20多億年前，遺傳相對保守，其廣泛分布于土壤、湖泊、海洋、南北極生態系統和荒漠，是生物量豐富、生產力較高的單細胞生物[4]。作為廣泛分布的單細胞藻類植物，小球藻是在單細胞水平上研究和建立轉基因表達系統及其相關條件優化和其他具有藥用價值的副產品開發和研究的絕佳材料。目前，由于四代生物燃料崛起，國內外關于小球藻基因組學、基因工程[5]的研究與開發日趨活躍。近幾年，隨著小球藻基因組測序[6]的完成，以及對其外源蛋白基因排斥與免疫[7-8]的深入研究，使得小球藻這種單細胞微生物成為最佳生物反應器的研究焦點，也是研究外源基因表達的最佳材料。

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是乳汁中一種重要的非血紅素鐵結合糖蛋白，是一種糖基化蛋白，分子量為70～80 ku、約700個氨基酸，基因的大小在2 112～2 530 bp之間；廣泛分布在初乳、牛奶及其相應的分泌物如眼淚、唾液中，是一種多功能性糖蛋白，在各種動物之間的同源性較高[9]。它能螯合生物體液中的鐵（Fe2+或Fe3+）或者破壞微生物的細胞膜，使其減少微生物（細菌、病毒和寄生蟲）的增殖、黏附或者將其殺死，從而表現出抗菌的作用[10]。人乳鐵蛋白（human lactoferrin，hLF）是一條多肽鏈折疊形成2個對稱的環狀結構（N and C lobes），包含部分α-螺旋鏈接域[11]。人乳鐵蛋白對免疫、細菌、病毒、微生物、抗寄生蟲和真菌都有相應的保護和抗性的作用，從而被開發成食品添加劑和保健品等。同時，科學界也將乳鐵蛋白列為新型抗生素的候選者[12]。目前，人乳鐵蛋白也被加工成嬰幼兒奶粉的食品添加劑，受到廣大消費者的青睞。但是，人乳鐵蛋白主要由初乳和血液來提取獲得，這就使得人乳鐵蛋白的產量少之又少，價格昂貴。因此，有科學家提出采用分子的手段去開發不同種類的乳鐵蛋白的重組體，以增加乳鐵蛋白開發和利用價值。

本試驗結合小球藻的優勢和人乳鐵蛋白的優點，首次以真核為宿主，在沙漠小球藻GTD8A1基因組上整合外源人乳鐵蛋白基因（hLF），利用小球藻細胞作為生物反應器及其生長周期短、傳代快速、代謝可控的優點，獲得穩定表達人乳鐵蛋白小球藻菌株，進而為小球藻生產人乳鐵蛋白下游工業提供優良的藻種。這將為人乳鐵蛋白的下游工業、商業化和推廣使用提供試驗基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 小球藻GTD8A1由筆者所在實驗室分離、純化和鑒定得到。小球藻GTD8A1所用BBM培養基[13]：NaNO3 250.00 mg/L，KH2PO4 175.00 mg/L，K2HPO4 75.00 mg/L，MgSO4·7H2O 75.00 mg/L，CaCl2·2H2O 25.00 mg/L，NaCl 25.00 mg/L，EDTA 50.00 mg/L，KOH 31.00 mg/L，FeSO4·7H2O 4.98 mg/L，H3PO4 11.42 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.82 mg/L，MnCl2 1.44 mg/L，MoO3 0.71 mg/L，CaSO4·5H2O 1.57 mg/L，Co（NO3）2·6H2O 0.49 mg/L，98% H2SO4 2 μl/L。

1.1.2 菌株與質粒 大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α菌株為筆者所在實驗室保存；植物表達載體pCAMBIA2300-35S-OCS，由石河子大學生命科學學院黃先忠老師饋贈。endprint

1.1.3 引物設計及合成 從NCBI上獲取人乳鐵蛋白的基因序列（NM-002343.4），通過Primer 5軟件設計引物（表1）。

1.2 方法

1.2.1 藻種培養及其條件 取對數生長末期的小球藻培養液，按10%的接種量接入裝有100 mL BBM培養基的250 mL錐形瓶中，置于光照培養箱中靜止培養，培養條件為：光照度100 μmol/（m2·s），光-暗周期12 h-12 h，培養溫度（23.0±05 ℃）。

1.2.2 人全血RNA的提取和人乳鐵蛋白基因的克隆 采用Trizol試劑提取人血總RNA，試驗步驟按說明書進行。總RNA產物用1%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，30 min）檢測。以提取的RNA為對象，采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific，EU）說明書合成cDNA第一鏈。再以此cDNA為模板，以hLF-F2/hLF-R2為特異性引物，對人乳鐵蛋白基因進行PCR擴增，反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 變性60 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸 2.5 min，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。對PCR產物進行切膠回收，得到人乳鐵蛋白基因，將目的基因連接到T4（TaKaRa，China）載體中，并轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，涂布于含有卡那霉素（30 mg/L）平板培養基上進行藍白斑篩選，挑取白色菌落進行菌落PCR鑒定。最后將鑒定的陽性克隆送深圳華大基因科技有限公司測序，對測序結果進行blast比對。

1.2.3 構建重組植物表達載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS 將目的基因hLF的回收產物和載體pCAMBIA2300-35S-OCS用KpnⅠ和XbaⅠ分別雙酶切4 h，其過程和反應體系按TaKaRa的說明書進行。將hLF酶切產物與載體酶切產物在連接酶的作用下16 ℃連接過夜，其過程和反應體系也按TaKaRa的說明書進行。通過熱激法將連接產物導入到大腸桿菌DH5α感受態細胞中。然后將感受態細胞涂布于含有卡那霉素（30.0 mg/L）平板培養基上，挑取白斑菌落作為模板，以hLF-F1/ hLF-R1為引物進行菌落PCR鑒定，采用質粒小提試劑盒所述步驟提取重組載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS，并用KpnⅠ和XbaⅠ進行雙酶切驗證。

1.2.4 表達載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS轉化小球藻情況的檢測 利用電轉化方法[14]將構建好的表達載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS導入小球藻GTD8A1中，將電擊后的小球藻細胞涂于含30 mg/L卡那霉素的BBM培養基上，挑取平板上長出的單藻落，放在10 μL的ddH2O中，95 ℃ 變性后作為模板，以hLF-F1/hLF-R1為引物進行PCR驗證。陽性轉基因藻種GTD8A1-hLF轉入到含有 50 mg/L 卡那霉素的BBM培養基中培養，用于后續試驗。

1.2.5 SDS-PAGE和Western Blot分析 小球藻蛋白的提取采用植物蛋白提取試劑盒（TIANGEN，China），具體操作步驟見說明書。Western Blot 過程參照Lin等的試驗方法[15]。

1.2.6 培養周期的優化 在含有50 mg/L卡那霉素的BBM培養基中，分別于處理后0、4、8、12、16、20、24、28 d測定其總蛋白含量（g/L）和人乳鐵蛋白含量（mg/L）。其中，總蛋白含量（g/L）按考馬斯亮藍說明書進行，人乳鐵蛋白含量（mg/L）按Elisa試劑盒說明書進行。

2 結果與分析

2.1 人全血RNA提取和人乳鐵蛋白基因的克隆

通過Trizol法提取人全血的RNA后，采用反轉錄試劑盒和PCR克隆得到2 133 bp的人乳鐵蛋白基因，經測序分析證實，人乳鐵蛋白基因序列與GenBank（登錄號NM-002343.4）公開的人乳鐵蛋白基因全長序列99%相同，說明目的基因克隆成功，其中電泳檢出了200 bp的條帶可能是由于引物添加過多而引起的引物二聚體造成的試驗現象，這對目的基因回收不產生影響，可以進行后續試驗，其結果見圖1。

2.2 植物表達載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS構建和驗證

本試驗采用雙酶切和DNA酶連接的試驗方法構建表達載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS，表達載體構建過程見圖2。構建好的載體通過熱激的方法導入到大腸桿菌DH5α細胞中，然后進行藍白斑篩選，試驗結果見圖3。由圖3可知，挑選白斑菌落擴大培養后，提取質粒載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS，將提取好重組質粒載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS送深圳華大基因科技有限公司測序分析證實，人乳鐵蛋白基因也整合到重組質粒當中。同時對重組質粒載體PCR和雙酶切檢測，得到2 133 bp的目的條帶。

2.3 DNA和RNA分析

將菌落PCR檢測為陽性小球藻菌落，經過含有抗性BMM液體培養基擴大培養后。采用植物DNA提取試劑盒和Trizol分別提取DNA和RNA，以hLF-F1/hLF-R1為引物進行分子水平上分析，通過PRC和RT-PCR分析得到5、6、8、10號小球藻含有2 133 bp的目的條帶，通過結果表明，人乳鐵蛋白基因也能整合到小球藻細胞中，并且得到轉錄，結果與預期一致（圖4）。

2.4 SDS-PAGE和Western Blot分析

將DNA和RNA分子水平上鑒定的5、6、8、10藻種再一次在含有抗性的BBM液體培養基中擴大培養后，采用植物總蛋白提取試劑盒提取轉基因藻的總蛋白，通過SDS-PAGE和Western Blot檢測得到70 ku的目的蛋白條帶。其中，圖 5-A 中條帶 5 為 5 號藻蛋白SDS-PAGE試驗結果；條帶6endprint

為6號藻蛋白SDS-PAGE試驗結果；條帶8為8號藻蛋白SDS-PAGE試驗結果；條帶10為10號藻蛋白SDS-PAGE試驗結果；11號為空白對照SDS-PAGE試驗結果。圖5-B中序號與圖5-A一致，只是圖5-B是Western Blot的試驗結果。

2.5 培養周期的優化

將藻種（GTD8A1-hLF）在不同的培養時間下，測定人乳鐵蛋白的人乳鐵蛋白含量和總蛋白含量，進行3次測量試驗結果的平均值。由圖6可知，最佳的培養周期為20 d，其人乳鐵蛋白含量和總蛋白含量分別為 13.28 mg/L、12.73 g/L。其中，通過RT-PCR預測人乳鐵蛋白的表達結果與用Elisa測定的試驗結果一致，獲得的最適培養周期將作為以下試驗的培養周期。

3 討論

試驗在宿主小球藻GTD8A1的基因組上插入外源hLF基因對其進行基因改造并成功表達，建立了人乳鐵蛋白的沙漠小球藻的表達系統，并通過相關的手段進行鑒定。從人血中獲取RNA克隆出cDNA到人乳鐵蛋白的表達，其相關的試驗結果都得到驗證（圖1～圖6）。圖1-B中出現200 bp左右的條帶，這與所需要的目的條帶2 133 bp條帶不在同一位置上，造成這樣的原因可能是引物二聚體的出現，但這不會對后續試驗造成影響；圖5-A中獲得了70 ku目標條帶和雜帶，同時在11號空載樣的位置上沒有看見目標條帶的出現，但是通過Western Blot試驗后在圖5-B中11號空載樣的位置也沒有出現目標條帶，結果表明，人乳鐵蛋白的沙漠小球藻的表達系統構建成功。

人乳鐵蛋白的最初生產主要來自于初乳的分離和純化，其產量小不利于規模化生產，這就須要探索一種技術來解決其所存在的問題。藻類早期研究主要利用其自身細胞合成產物，如β-胡蘿卜素、二十二碳六烯酸（DHA）和蝦青素等[16-17]，來開發具有商業和藥用價值的生物產品，隨后也有研究者利用藻類（如螺旋藻、小球藻和柵藻）生物反應器來生產一些蛋白保健食品[18]。例如，Koo等成功構建牛乳鐵蛋白的小球藻表達系統并且表達成功，使得藻類為轉基因宿主以及構建人乳鐵蛋白的表達系統提供可能，利用帶CaMv35s啟動子的表達載體pCAMBIA1304成功構建牛乳鐵蛋白的小球藻表達系統并且表達成功，獲得目標基因序列部分長為 1.1 kb，通過SDS-PAGE和Western Blot技術檢測到35 ku的蛋白條帶[14]，盡管筆者沒有獲得牛乳鐵蛋白的全長，但是其研究使得藻類成為轉基因宿主以及在其細胞中構建人乳鐵蛋白的表達系統可能。然而，本研究通過帶CaMv35s啟動子的表達載體pCAMBIA2300的植物表達載體，成功構建了人乳鐵蛋白基因全長的沙漠小球藻表達系統，獲得轉基因藻種GTD8A1-hLF，并通過PCR手段檢測到人乳鐵蛋白基因全長為2 133 bp，以及通過SDS-PAGE和Western Blot技術檢測到70 ku的蛋白條帶，這將為小球藻生產人乳鐵蛋白全長提供了可能。

然而，國內對人乳鐵蛋白轉基因的研究主要集中在酵母、水稻和動物（牛）等真菌和高等動物中，Jiang等在畢赤酵母細胞中成功表達了人乳鐵蛋白，其蛋白濃度高達1 200 mg/L，但是蛋白活性不高，促使人們進一步的開發其他表達系統[19]；吳景歡在水稻種成功表達重組人乳鐵蛋白，其蛋白含量為05%[20]；文勝通過基因工程的手段獲得轉人乳鐵蛋白的牛初乳，并且構建了相應的表達體系，其蛋白濃度在2.5～3.5 mg/L 之間[21]。國外對乳鐵蛋白轉基因研究主要集中在馬鈴薯和動物（小鼠）等高等植物和動物中，Chong等在馬鈴薯中成功的構建和表達了人乳鐵蛋白，其蛋白表達濃度為可溶性蛋白總濃度的0.1%[22]；Choi等在馬鈴薯中成功建立了人乳鐵蛋白的表達載體，其蛋白表達濃度為可溶性蛋白總濃度的3%[23]；Hwang等在小鼠中構建完成人乳鐵蛋白的表達體系[24]。通過對國內外轉基因人乳鐵蛋白研究發現，在沙漠小球藻進行人乳鐵蛋白的表達還鮮有研究，本研究獲得的表達系統表達的人乳鐵蛋白的含量在13.28 mg/L，與前人的研究有相似之處，但是該表達系統還有待進一步進行產物優化研究。

本試驗通過目的基因的克隆、載體的構建、轉化、分子水平分析以及SDS-PAGE和Western Blot驗證，最終獲得了能成功表達人乳鐵蛋白的植物表達載體，同時上游重組蛋白的表達系統也構建完成，可以為下游提供必要的技術基礎和早期的藻種。雖然，人乳鐵蛋白能在小球藻中表達，但是想要將此技術運用到下游工業中還有一定的困難，原因在于：第一，本試驗只是獲得能表達人乳鐵蛋白的沙漠小球藻，所有的試驗都是在實驗室的條件下進行的，若是想要運用到下游工業生產當中，還須要進一步對其產物條件進行優化研究和摸索，影響規模發酵的諸多條件如重組小球藻在反應器當中的最適溫度、pH值、光照條件和培養基等。第二，想要重組人乳鐵蛋白的小球藻能夠生產安全、穩定的人乳鐵蛋白，那么分離和提取工藝還須要進一步地探索。如何在分離提取的過程中不產生對人體有毒害物質，而且又不損失應用價值和功能，是重組人乳鐵蛋白作為功能性食品和食品添加劑的重要條件之一。第三，后期處理的成本也是發展的關鍵問題。相信隨著對微藻研究和認識的進一步深入，以及下游工業的分離和提取技術的發展，這些問題都將在短時間內得以解決，未來運用微藻生產人乳鐵蛋的應用前景將不可限量。

4 結論

本試驗通過RNA和DNA的提取，采用PCR、RT-PCR、測序以及SDS-PAGE和Western Blot等技術手段，成功地在沙漠小球藻中建立了人乳鐵蛋白的表達系統，獲得了能夠表達人乳鐵蛋白的重組表達載體pCANBIA2300-35S-hLF-OCS，其人乳鐵蛋白的表達濃度為13.28 mg/L。

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