大苞水竹葉組培快繁及再生體系的建立

李翠+韋瑩+李林軒+郭曉云+趙以民+張占江

摘要：擬采用組織培養快繁技術解決大苞水竹葉種苗短缺和種質資源可持續開發利用的問題，從而為人工種植提供技術支持。對消毒劑、消毒時間進行篩選，以大苞水竹葉側芽為外植體，以MS、B5、N6為基本培養基，采用正交設計研究植物生長調節劑多因素組合[6-BA、KT、NAA、IAA、IBA、活性炭（AC）]對大苞水竹葉進行初代誘導、不定芽分化和誘導生根的影響。結果表明，體積分數為0.1%的氯化汞為最佳滅菌劑，滅菌時間為8 min時誘導率最高，最佳培養基為MS培養基；不定芽最佳誘導培養基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L KT，外植體經15 d誘導培養，可分化形成11個不定芽；MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L IAA最利于不定芽繼代增殖；MS+2.0 mg/L IBA+1.0 mg/L IAA最適于誘導生根獲得再生植株，生根率93.1%；生根苗宜移栽于泥炭+黃沙（體積比 3 ∶1）的基質上，成活率84%。由結果可以看出，該組培快繁途徑繁殖速度快、再生率高，有望為栽培大苞水竹葉提供大量種苗，為壯藥深入開發利用研究提供依據。

關鍵詞：大苞水竹葉；壯藥；組培快繁；再生體系

中圖分類號： Q945.51 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）19-0143-03

收稿日期：2016-04-28

基金項目：廣西中醫藥民族醫藥標準化課題（編號：GZBZ14-15）；廣西壯藥質量標準研究項目（編號：MZY2013052）。

作者簡介：李 翠（1982—），女，黑龍江依安人，碩士，助理研究員，主要研究方向為藥用植物繁育與保存。Tel：（0771）5602850；E-mail：licuicui941@aliyun.com。

通信作者：張占江，博士，副研究員，研究方向為藥用資源保護與開發利用。Tel：（0771）5603824；E-mail：zzj1811@163.com。 大苞水竹葉{Murdannia bracteata（C. B. Clarke） O. Kuntze[Aneilema bracteata （C. B. Clarke） O. Kuntze]}為鴨趾草科水竹草屬植物[1]，是著名的壯藥痰火草的源植物，為多年生常綠草本。大苞水竹葉根呈圓柱狀，長20～30 cm，花期5—8月，果期6—9月，主要生長在海拔500～850 m的水溝邊及密林下，分布于廣東、海南、廣西、云南等地。收載于《中華本草》《全國中草藥匯編》《廣西藥用植物名錄》等。大苞水竹葉多分布于長江以南各省（區），尤以西南地區為盛。其根入藥，具有較高的藥用價值，售價約100元/kg，具有逐水通便、消腫散結的功效，主治水腫，此外還有通經之效，用于治療慢性腎炎、晚期血吸蟲病腹水或其他肝硬變腹水等癥[2]。近年來，隨著市場需求量的不斷增加，野生大苞水竹葉資源瀕臨枯竭，生產上難以實現大面積栽培。采用生物技術組織培養技術，可以有效快速地提高大苞水竹葉種苗的繁殖速度和質量，滿足大苞水竹葉的市場需求，也可為壯藥痰火草資源可持續開發利用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和基本培養條件

本試驗所需材料采集自廣西壯族自治區藥用植物園引種繁育圃內引種栽培的生長健壯、無病蟲害的優良大苞水竹葉植株，選取其側芽作為外植體進行誘導，先將大苞水竹葉側芽表面洗凈去污，用濃度為75%的乙醇滅菌30～45 s，然后用無菌水沖洗1～3次，放入滅菌劑滅菌，再用無菌水沖洗2～5次，然后用無菌濾紙將側芽表層的水分吸干，最后將測芽置于基本培養基上進行誘導培養，在平均光照度2 000 lx下培養，光照時間12 h/d，溫度（24±2） ℃。

1.2 適宜滅菌條件的篩選

設計2組消毒試驗。第1組設計不同消毒劑種類：0.1% HgCl2 10 min，2% NaClO 20 min，50%的84消毒液20 min，2% H2O2 20 min，從中篩選最適合的消毒劑；第2組設計不同的消毒時間：5、6、7、8、9、10 min。所有的試驗都是在接種后 15 d 對試驗對象的污染率、成活率進行統計。

1.3 不定芽誘導分化條件的篩選

本試驗基于MS、B5、N6培養基，添加NAA、IAA、6-BA這3種不同類型激素，并開展NAA濃度（0.5、1.0、1.5 mg/L）、KT濃度（0.1、0.2、0.4 mg/L）、6-BA濃度（1.0、1.5、2.0 mg/L）的正交設計（表1），研究不同激素組合對大苞水竹葉不定芽誘導的影響，每個處理10瓶，每瓶4個外植體，20 d后記錄外植體的誘導情況，比較不同組合誘導不定芽能力的差異。

1.4 不定芽繁殖條件的篩選

在MS為基本培養基的基礎上，以6-BA、IAA為生長調節激素，考察大苞水竹葉不定芽繁殖情況。通過6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、IAA（0.2、0.4、0.6 mg/L）2種激素濃度組合試驗，對大苞水竹葉的繁殖培養基進行優化，每個處理10瓶，每瓶4個單芽，20 d后測定試管苗生長情況和芽增殖倍數[芽增殖倍數=（20 d后芽數-接種時芽數）/接種時芽數]，以芽增值倍數為主要考察指標來優化繁殖培養基。

1.5 生根條件的篩選

為了研究大苞水竹葉無菌苗生根壯苗的最適合培養基，以MS為基本培養基，對IBA濃度（1.0、2.0 mg/L）、活性炭（AC）濃度（0.5、1.0、1.5 mg/L）進行組合試驗，對大苞水竹葉的繁殖培養基進行優化，將生長健壯、高2～3 cm的無根苗接種于4種不同處理的生根培養基上，每個處理10瓶，每瓶8個單芽，培養40 d后統計結果，計算生根率與生根數平均值，相關公式如下：

生根率=（生根數/接種總數）×100%；endprint

生根數平均值=（總生根數/接種總數）×100%。

1.6 煉苗及移栽

當生根培養的大苞水竹葉瓶苗長至3～5 cm高、有3張以上葉片和3～5條根時，即可出瓶移栽。挑選生長旺盛、根系發達的試管苗，為使無菌苗移栽后適應自然環境，出瓶前在實驗室散射光下煉苗2 d，轉移至走廊處煉苗3 d，其間需向瓶內植株灑水以保持瓶內水分充足，將生根試管苗小心地從培養瓶中取出，用水洗凈根部殘留的培養基，單株栽入基質（V木屑 ∶V草炭土=3 ∶1），置于室內1周，2 d澆水1次，保持土質80%左右的濕潤度，溫度18～25 ℃，木屑保水性、透氣性都很好。30 d后統計不同基質中組培苗的成活率。

2 結果與分析

2.1 滅菌條件的選擇

如表2所示，0.1% HgCl2具有較好的消毒效果，外植體消毒成功率達到60%；NaClO、84消毒液、H2O2消毒效果均不夠理想，消毒不徹底，污染率高。由表3知：使用0.1% HgCl2消毒 8 min成功率最高，達到90%， 低于8 min時污染率高，

高于8 min時，污染率雖然降低，但是死亡率不斷升高。因此，綜合比較可知，較好的消毒劑為0.1% HgCl2，較好的消毒時間為8～10 min。

2.2 不定芽的誘導條件選擇

將頂芽分化獲得的不定芽進行快速繁殖培養，外植體接種到MS、B5、N6培養基中，在培養溫度為23～26 ℃、光照度為1 400～2 000 lx、光照時間為10～12 h/d的條件下培養15 d，側芽分化后獲得不定芽。B5培養基中側芽分化成愈傷褐化，N6培養基中側芽分化慢，系數低；MS培養基中含0.1～0.4 mg/L KT、1.0～2.0 mg/L 6-BA、1.0～2.0 mg/L NAA、20～30 g/L蔗糖和3.8～4.8 g/L瓊脂，培養基的pH值為58。觀察發現，隨著培養基中6-BA、NAA濃度的增加，大苞水竹葉不定芽數均增加。由表4可以看出，最優組合是A3B2C1，即在培養基中添加0.4 mg/L KT、1.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的不定芽繁殖效果最好，平均分化出11個不定芽。組培苗誘導的各個階段效果見圖1。

2.3 不定芽壯苗條件選擇

將“2.2” 節中得到的試管苗不定芽置于MS壯苗培養基中，在培養溫度23～26 ℃、光照度1 400～2 000 lx、光照時間10～12 h/d的條件下培養40 d，得到健壯植株，其中MS壯苗培養基中含0.5～1.5 mg/L 6-BA、0.2～0.6 mg/L IAA、20～30 g/L蔗糖和3.8～4.8 g/L瓊脂，培養基的pH值為5.8，觀察發現，培養基中添加1.0 mg/L 6-BA和0.6 mg/L IAA時壯苗效果最好，株高達到5.37 cm（表5）。

2.4 健壯植株生根培養條件選擇

將得到的健壯植株置于生根培養基中，在培養溫度23～26 ℃、光照度1 400～2 000 lx、光照時間10～12 h/d的條件下培養40 d，得到帶根的完整植株，其中MS生根培養基中含0.5～1.5 mg/L IAA、1.0～2.0 mg/L IBA、25～30 g/L蔗糖和3.8～4.8 g/L瓊脂，培養基的pH值為5.8。觀察發現，隨著培養基中IAA濃度增加，組培苗的生根率也提高；培養基中添加2.0 mg/L IBA和1.0 mg/L IAA的生根效果最好，生根率達93.1%，平均根長達到4.49 cm（表6）。

2.5 試管苗移栽條件

經生根培養后的大苞水竹葉，挑選生長旺盛、根系發達的試管苗移入常溫室內放置，擰松蓋子，2 d后掀開蓋子讓大苞水竹葉幼苗與空氣完全接觸，其間需向瓶內的植株灑水以保持瓶內的水分充足。3 d后從瓶內取出幼苗，洗凈根部的培養基，移栽于消過毒的泥炭、泥炭+蛭石（體積比3 ∶1）、泥炭+黃沙（體積比3 ∶1）3種不同基質上，適度遮陰，并保持一定的濕度。30 d后統計生根率和生長率。由表7可以看出，不同基質成活率的高低順序為泥炭+黃沙（體積比3 ∶1）>泥炭+蛭石（體積比3 ∶1）>泥炭。因此，試管苗移栽最好的基質為泥炭+黃沙（體積比3 ∶1），移栽30 d成活率為84%。

3 討論

鴨跖草科植物均為草本，主要分布于熱帶，少數種產于亞熱帶、溫帶地區，中國產13屬49種，多分布于長江以南各省（區），尤以西南地區為盛。目前對鴨跖草科植物的研究開展的較少，僅有關于其生物學特性[1-2]、分布與分類[3]、種植栽培、病蟲害[4]、化學成分[5-7]、藥理作用的報道[8]，未見有關組培的報道。本研究采用大苞水竹葉側芽為外植體，以芽繁芽，未經過愈傷組織階段，對側芽分化及植株再生方法進行探討，建立了大苞水竹葉的離體再生體系，有利于保持大苞水竹葉的遺傳穩定性，不但滿足了工廠化生產的需求，還具有實際意義。

植物生長調節劑是培養基中的關鍵物質，能以極微小的量影響植物的細胞分化、分裂和發育，在植物離體培養中起重要調節作用[9]。當細胞分裂素/生長素的比值合適時，能誘導芽的形成和促進芽的生長。6-BA是重要的細胞分裂素，能促進細胞分裂、非分化組織分化、側芽生長等；NAA是植物生長調節劑，具有促進細胞分裂與擴大、誘導形成不定根等作用；IAA是植物生長素，能促進細胞分裂與細胞生長，誘導形成不定根[10-11]。多種激素組合能更有效地促進植物的生長，因此在MS培養基中加入6-BA、IAA配合使用，對大苞水竹葉生長均具有較大的影響。本研究得出，大苞水竹葉增殖的最適培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L IAA，在此培養基上增值率為6.5且芽苗翠綠粗壯。試驗中不定芽生根率達93.1%，移栽成活率為98%，生產出的種苗，既可滿足人們對大苞水竹葉的用途需求，又可保護珍稀瀕危種質資源，同時還為豐富我國園林植物種類提供保障。本研究為著名壯藥植物大苞水竹葉的保護和可持續開發利用開辟了一條新的途徑，同時可為同屬其他物種的組織培養研究提供借鑒。

參考文獻：

[1]《全國中草藥匯編》編寫組. 全國中草藥匯編 下冊[M]. 北京：人民衛生出版社，1996：645.

[2]國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M]. 上海：上海科學技術出版社，1998：305.

[3]Faden R B.The author and typification of Tradescantia zebrina （Commelinaceae）[J]. Kew Bulletin，2008，63（4）：679-680.

[4]王大紹. 曲膝水竹草及水竹草屬在我國的傳播、危害和防治[C]//第十屆全國生物多樣性保護與持續利用研討會論文集. 哈爾濱，2012.

[5]樊效琪，徐亞銘，劉星諧. 水竹草抗腫瘤成分的研究，中成藥，1992，14（2）：34-35.

[6]楊春欣. 水竹草抗心律失常成分的分離及鑒定，天然產物研究與開發，1996，8（3）：17-19.

[7]湯 峰，吳靜義，張 劍，等. 水竹葉的化學成分[J]. 吉林大學學報：理學版，2013，51（4）：724-726.

[8]莊雅玲，郭月雄，郭宗甫. 中草藥白花水竹草（Tradescantia albifora Kunth）降低血液尿酸之功能及抗氧化性研究[C]//中國畜牧獸醫學會中獸醫分會學術年會. 蘭州，2015.

[9]林夏斌，黃華達，黃懷妹，等. 白花擬萬代蘭（Vandopsis undulata）組培苗的增殖、生根與煉苗[J]. 江蘇農業科學，2016，44（2）：56-59.

[10]楊 濤，錢 蕾，呂永桂，等. 豐花月季低成本組織培養快繁的研究[J]. 江蘇農業科學，2015，43（8）：53-55.

[11]黎海利，譚飛理，劉鍇棟，等. 聚花過路黃的組織培養和快速繁殖[J]. 江蘇農業科學，2015，43（6）：51-53.endprint