無患子、木荷、廣玉蘭提取物組方復配及其抗稻瘟病體內、體外活性研究

楊小輝　彭玉萌　霍光華　李芳　龍昊知

摘要：為了開發植物源抗稻瘟病制劑，借鑒Wadley法評價植物源農藥復配聯合作用的思路，將參與組方的單劑引起25%抑菌率的劑量定為中間水平，應用均勻設計安排試驗來實現3種植物醇提物抗稻瘟病病菌活性組方的優化配比。對水稻秧苗進行抗稻瘟病體內、體外活性試驗，確定了具有增效作用的3種組方，即組方Ⅰ為無患子與廣玉蘭醇提物濃度的比值為1 ∶5，組方Ⅱ為無患子與木荷醇提物濃度的比值為1.0 ∶2.8，組方Ⅲ為無患子、廣玉蘭、木荷醇提物濃度的比值為4.3 ∶19.0 ∶1.0，體外測得各組方的EC50分別為193.1、132.5、256.1 mg/L，體內盆栽測得各組方的EC50分別為25 637、7 267、7 560 mg/L。無論是易感稻種還是抗性稻種，當組方Ⅱ和組方Ⅲ的濃度達到4%時，對稻瘟病的預防和治療作用均接近完全控制，效果均優于生產上使用的三環唑。表明無患子、木荷、廣玉蘭等植物有潛在開發抗稻瘟病制劑的價值。

關鍵詞：無患子；木荷；廣玉蘭；提取物；均勻設計；抗稻瘟病組方

中圖分類號： S482.2+92 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）19-0179-04

收稿日期：2016-10-08

基金項目：國家自然科學基金（編號：21266010）；江西省自然科學基金（編號：20142BAB214023、20132BAB204028）。

作者簡介：楊小輝（1990—），男，江西南昌人，碩士研究生，主要從事植物與菌物活性產物研究。E-mail：835017787@qq.com。

通信作者：霍光華，博士，教授，主要從事植物與菌物活性產物研究。E-mail：hgh3828079@sohu.com。 水稻是世界主要的糧食作物之一，稻瘟病是由稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）引起的水稻災難性的病害，該病潛伏期長，發病部位多，危害嚴重。為了防治稻瘟病，人類把主要精力集中在選育水稻抗性品種和開發殺瘟劑上，但抗性品種并不能獲得對高度變異的稻瘟病菌的持續抗性，同時攜帶抗稻瘟病基因的水稻還存在所產稻米品質低下等問題，因此，化學防治成為水稻生產上防治稻瘟病的一種不可缺少的手段。目前，大面積用于防治稻瘟病的化學殺菌劑三環唑等存在環境殘留問題，已發現對富士一號具有抗藥性的稻瘟病菌變異株，人們期望獲得結構新穎、作用方式獨特的天然活性產物，從而開發出可以扼制稻瘟病菌高度變異的殺稻瘟劑[1-2]。

無患子（Sapindus mukorossi Gaertn.）主要分布于我國南部、印度、日本和朝鮮半島，該植物具有廣泛的藥用價值，其果實可治療過度流涎、丘疹、癲癇、萎黃病、偏頭痛、濕疹、牛皮癬等病，其種子粉可治療齲齒、關節炎、普通感冒、便秘、作嘔等病，其種子可以去除皮膚黃褐色和雀斑、清洗皮膚油性分泌物、制洗發劑等，葉片用于浴池可減緩關節痛、根治痛風、風濕病等[3]。主要活性成分是其所含的皂苷物質，已發現無患子總皂苷提取物具有抑制光滑念珠菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌[4]、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌和幽門螺旋桿菌等細菌的活性，且幽門螺旋桿菌等菌不會對該提取物產生抗性[5]，該提取物還可以抑制黑曲霉菌[6]、苜蓿炭腐病病菌[Rhizoctonia bataticola （Taub.）Butl.]和黃連白絹病病菌（Sclerotium rolfsii）[7]等的活性。

木荷（Schima superba Gardn. et Champ.）是我國中部到南部常綠闊葉林、常綠闊葉-落葉混交林的優勢樹種或群落上層的共建樹種。它具有優良的防火特性，有時也用作藥物。福建省山區農民使用木荷樹皮粉驅散野豬和鳥類等以防其糟踏農作物[8]；臺灣排灣族人曾用木荷樹皮毒殺魚，其毒性比魚藤更劇烈，也有人將木荷莖皮作為箭毒使用[9]。近年來發現，木荷莖皮甲醇提取物可浸殺福壽螺幼螺，并能抑制其上爬[10]；木荷樹皮甲醇提取物能引起小菜蛾和菜青蟲拒食[11]；用木荷與油茶等60余種植物材料提取物可組成殺蟲劑[12]。

本試驗從百余種植物中篩選出對稻瘟病病菌具有較強抑制活性的植物材料無患子和木荷等，經組方配比和體內、體外活性試驗，篩選出具有防治稻瘟病和增效的活性組方。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物醇提物 試驗材料為前期研究中篩選出的植物材料無患子果皮、廣玉蘭（Magnolia grandiflora Linn. ）葉、木荷葉，用乙醇溶液提取制得各醇提液，然后將各醇提液真空濃縮至浸膏狀備用[13-14]。

1.1.2 供試菌株和稻種 供試菌株為稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）菌株Z72-1，水稻品種為C101PKT（1種易感印度品種）和兩優287（抗性品種），均由江西省農業科學院植物保護研究所提供。

1.1.3 供試農藥 75%三環唑可濕性粉劑，購自江蘇禾笑化工有限公司。

1.1.4 培養基 PDA培養基：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、15～20 g瓊脂、1 000 mL自來水，pH值自然；稻稈玉米培養基：40 g稻稈、20 g玉米、20 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 稻瘟病菌孢子懸浮液制備 取培養10 d后的產孢平板（稻稈玉米培養基），用無菌水洗下孢子，4層紗布過濾，調節孢子懸浮液濃度至1×105個/mL，備用。

1.2.2 各醇提物抑菌活性的測定 采用菌絲生長速率法測定各醇提物的抑菌活性[15]。

抑菌率=對照菌落直徑-處理菌落直徑對照菌落直徑×100%。

按照生物統計學概率值換算表將抑菌率換算成概率值（y），以概率值作為因變量，以濃度的對數值（x）作為自變量建立毒力回歸方程（y=ax+b），利用毒力回歸方程求得概率值為5時的濃度值即為半最大效應濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）。同樣的方法計算出概率值為4.325 5時的濃度值即為1/4最大效應濃度（concentration for 25% of maximal effect，EC25）。endprint

1.2.3 植物醇提物組方設計和體外藥效評價 根據“1.2.2”節的試驗結果，擬合各醇提物的抗稻瘟病病菌毒力方程，計算出各醇提物的EC25值，并以此為試驗中間水平安排均勻設計。應用DPS軟件逐步回歸，求得試驗指標抑菌率Y和因素濃度對數X（無患子、廣玉蘭、木荷分別為A、B、C）之間的關系，確定獲得最高試驗指標時各醇提物的濃度配比，并進行驗證[16-19]。

使用Wadley法，根據增效系數（SR）來評價藥劑混用的增效作用，即SR≥1.5表示具有增效作用；SR≤0.5表示具有拮抗作用；0.5

X1=（PA+PB+PC）/（PA/IA+PB/IB+PC/IC）×100。（1）

式中：X1為混劑的EC50理論值，mg/L；PA、PB、PC分別為混劑中A、B、C的百分含量，%；IA、IB、IC分別為混劑中A、B、C的EC50值，mg/L。

SR=X1X2。（2）

式中：SR為混劑的增效系數；X1為混劑的EC50理論值，mg/L；X2為混劑的EC50實測值，mg/L。

1.2.4 盆栽試驗[20]和體內藥效評價 盆栽試驗于2012年在江西省農業科學院植物保護研究所溫室內進行，在供試水稻3～4葉期時，噴霧接種稻瘟病菌孢子懸浮液（孢子濃度為1×105個/mL），噴藥量以水稻葉片表面有1層薄霧為度，每個處理3次重復。

1.2.4.1 預防作用試驗 首先在水稻秧苗上噴藥，24 h后人工接種稻瘟病病菌，置于26 ℃恒溫保濕箱中，遮光保濕24 h后取出，用噴霧器噴水保濕，每天3～5次，從接種后的第2天開始觀察，第10天調查各處理的發病情況，以在秧苗上噴清水作為對照（CK），根據病情指數計算防治效果。

1.2.4.2 治療作用試驗 首先在水稻秧苗上人工接種稻瘟病菌，26 ℃恒溫保濕24 h后噴藥，繼續保濕，從施藥后的第2天開始觀察，第10天調查發病情況，以在秧苗上噴清水作為CK，根據病情指數計算防治效果。

1.2.4.3 秧苗葉瘟病情具體的分級標準[21-22] 0級：無病；1級：針頭狀大小褐點；2級：稍大褐點；3級：小圓形至稍長的灰色病斑，邊緣褐色，病斑直徑1～2 mm；4級：典型紡錘形病斑，病斑長1～2 cm，通常局限在2條葉脈之間，受害面積不超過葉片總面積的2%；5級：典型病斑，受害面積占葉片總面積的3%～10%；6級：典型病斑，受害面積占葉片總面積的11%～25%；7級：典型病斑，受害葉面積占葉片總面積的26%～50%；8級：典型病斑，受害葉面積占葉片總面積的51%～75%，多數葉片枯死；9級：全葉枯死。

體內藥效評價方法按照公式（3）、公式（4）進行。

病情指數=100×∑（各級病葉數×各級代表值）/（調查總葉數×最高級代表值）；（3）

防治效果=CK1-PT1CK1×100%。（4）

式中：CK1為清水對照的病情指數；PT1為藥劑處理的病情指數。

2 結果與分析

2.1 3種植物醇提物抑制水稻稻瘟病病菌菌絲生長的EC25和EC50

2.2 組方復配結果

2.2.1 二元組方 以上述任意2種植物醇提物的EC25值為中間水平，安排均勻設計水平表，按照均勻試驗表進行試驗，測定各組方的抑菌活性，并進行分析和驗證，獲得2個具有增效作用的二元組方，分別為組方Ⅰ和組方Ⅱ。

對表2各試驗的濃度對數值與抑菌率進行線性回歸，獲得回歸方程為Y=76.281 4+0.376 5XA-0.218 0XB-0.002 1XA2+0.000 1XB2+0.000 5XAXB，經方差分析，該方程具有統計學意義（P=0.004 6<0.05），因素間的最佳組合為XA=238.2 mg/L、XB=1 187.7 mg/L，即無患子與廣玉蘭醇提物濃度的比值為 1 ∶5。驗證試驗獲得組方Ⅰ的毒力回歸方程為Y=3.548 4 X+7.534 6，相關系數為0.995 2，EC50的理論值X1和實測值X2分別為611.2、193.1 mg/L，故SR=3.2，為增效作用。

2.2.2 三元組方 對表4各試驗的濃度對數值與抑菌率進行回歸，獲得回歸方程為Y=-31.120 1+0.206 9XA+0.144 0XB+0.365 5XC-0.000 4XB2-0.000 3 XC2-0.000 3XBXC，經方差分析，該方程具有統計學意義（P=0030 3<005），因素間的最佳組合為XA=266.4 mg/L、XB=1 187.3 mg/L、XC=62.6 mg/L，即無患子、廣玉蘭、木荷醇提物濃度的比值為4.3 ∶19.0 ∶1.0。驗證試驗獲得組方Ⅲ的毒力回歸方程為Y=4.036 0 X+7.387 4，相關系數為0995 9，EC50的理論值X1和實測值X2分別為584.8、256.1 mg/L，故SR=2.3，為增效作用。

2.3 各組方防治稻瘟病的效果

2.3.1 對易感水稻品種C101PKT盆栽感染稻瘟病的預防和治療作用 由表5數據可計算出各材料單獨或組方對易感水稻品種C101PKT盆栽感染稻瘟病預防作用的毒力方程和EC50，無患子、木荷、組方Ⅰ、組方Ⅱ、組方Ⅲ的毒力方程和EC50分別為Y=0.003 7X+21.206、Y=0.001 9X+15.065、Y=0.001 1X+21.799、Y=0.001 5X+39.099、Y=0.001 5X+38.660，7 782、18 386、25 637、7 267、7 560 mg/L。無患子、木荷、組方Ⅰ、組方Ⅱ、組方Ⅲ對該水稻品種的治療作用毒力方程和EC50分別為Y=0.003 7X+11.959、Y=0.001 2X+31227、Y=0.001 1X+21.299、Y=0.001 5X+38.021、Y=0001 5X+37.582，10 281、15 644、26 092、7 986、8 279 mg/L。由此可知，對易感水稻品種C101PKT盆栽感染稻瘟病的防治效果表現為組方Ⅱ>組方Ⅲ>無患子>木荷>組方Ⅰ。除了木荷材料外，治療作用所需要的濃度高于預防作用所需要的濃度，即同濃度的單劑或組方預防效果優于治療效果。

2.3.2 對抗性水稻品種兩優287盆栽感染稻瘟病的預防和治療作用 由表6數據可計算出各材料單獨或組方對抗性水稻品種兩優287盆栽感染稻瘟病的預防作用毒力方程和EC50，無患子、木荷、組方Ⅰ、組方Ⅱ、組方Ⅲ的預防作用毒力方程和EC50分別為Y=0.003 7X+20.73、Y=0.001 9X+14436、Y=0.001 1X+21.209、Y=0.001 5X+38.442、Y=0001 5X+37.542，7 980、18 718、26 174、7 705、8 305 mg/L。無患子、木荷、組方Ⅰ、組方Ⅱ、組方Ⅲ對該水稻品種的治療作用毒力方程和EC50分別為Y=0.003 6X+10.413、Y=0.001 2X+27.903、Y=0.001 1X+19.985、Y=0.001 4X+36.678、Y=0001 5X+36.129，10 996、18 414、27 286、9 516、9 247 mg/L。由此可知，對抗性水稻品種兩優287盆栽感染稻瘟病的預防和治療效果分別表現為組方Ⅱ>無患子>組方Ⅲ>木荷>組方Ⅰ、組方Ⅲ>組方Ⅱ>無患子>木荷>組方Ⅰ。對各單劑和組方，治療作用所需要的濃度均高于預防作用所需要的濃度。

比較表5和表6的數據及各單劑和組方的EC50可知，無論是預防還是治療稻瘟病，對水稻抗性品種的防治比對水稻易感品種的防治需要更高的藥劑濃度。

3 結論與討論

無患子、廣玉蘭、木荷的醇提物單劑及其組方對水稻稻瘟病病菌菌絲的生長均有一定的抑制作用。3種植物醇提取物的EC50表現為廣玉蘭>木荷>無患子。獲得的3種具有增效作用的組方為無患子、廣玉蘭醇提物濃度的比值為1 ∶5，無患子、木荷醇提物濃度的比值為1.0 ∶2.8，無患子、廣玉蘭、木荷醇提物濃度的比值為4.3 ∶19.0 ∶1.0，體外測得各組方的EC50分別為193.1、132.5、256.1 mg/L，體內盆栽測得各組方的EC50分別為25 637、7 267、7 560 mg/L。其中組方Ⅱ、Ⅲ的活性較強，無論對易感稻種還是抗性稻種，當組方Ⅱ和組方Ⅲ濃度達到40 000 mg/L時，對稻瘟病的預防和治療作用均接近完全控制，效果均優于生產上使用的三環唑（750 mg/L）。

無患子醇提物具有較強的抗稻瘟病活性，其在同樣提取物濃度下的抗稻瘟活性有時甚至超過組方，但考慮到其果皮來源十分有限，因此應用組方更切實際。

在體內盆栽抗稻瘟病的試驗中發現，抗性品種感染的稻瘟病比易感品種感染的稻瘟病需要更高的藥劑濃度才能達到同樣的防治效果。在同種水稻品種上，治療稻瘟病比預防稻瘟病需要更高的藥劑濃度。

雖然使用組方防治稻瘟病需要的濃度比陽性對照三環唑的濃度（750 mg/L）更高，但組方具備天然植物源提取物、無殘留、不會產生抗藥性等優點，有利于克服化學藥劑環境殘留[23]和稻瘟病病原產生抗藥性[24]的問題，因此，所獲得的組方Ⅱ和組方Ⅲ具有一定的應用價值，可用于綠色稻米生產。

參考文獻：

[1]霍光華，嚴 偉，符金華，等. 抗稻瘟病菌活性多植物提取物組方研究[J]. 生物災害科學，2012，35（1）：27-36.

[2]Normile D. Plant genetics：New strategy promises lasting resistance to a rice plague[J]. Science，2009，325（5943）：925.

[3]Upadhyay A，Singh D K. Pharmacological effects of Sapindus mukorossi[J]. Revista Do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo，2012，54（5）：273-280.

[4]Talwar G P，Dar S A，Rai M K，et al. A novel polyherbal microbicide with inhibitory effect on bacterial，fungal and viral genital pathogens[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，2008，32（2）：180-185.

[5]Ibrahim M，Khan A A，Tiwari S K，et al. Antimicrobial activity of Sapindus mukorossi and Rheum emodi extracts against H. pylori：in vitro and in vivo studies[J]. World Journal of Gastroenterology，2006，12（44）：7136-7142.

[6]趙志敏，南艷平，唐青濤，等. 無患子總皂苷的體外抑菌及抗氧化活性研究[J]. 時珍國醫國藥，2013，24（4）：799-801.

[7]Saha S，Walia S，Kumar J，et al. Structure-biological activity relationships in triterpenic saponins：the relative activity of protobassic

acid and its derivatives against plant pathogenic fungi[J]. Pest Management Science，2010，66（8）：825-831.

[8]黃光強. 用木荷樹皮粉末作為非殺傷性驅散武器填充劑的設想[J]. 森林公安，2002（2）：20.endprint

[9]陳冀勝，鄭 碩. 中國有毒植物[M]. 北京：科學出版社，1987：584-586.

[10]駱 悅，曾鑫年，居建華，等. 40種植物甲醇提取物的殺螺活性研究[J]. 植物保護，2005，31（1）：31-34.

[11]鄧志勇，鄧業成，劉艷華. 木荷提取物對小菜蛾和菜青蟲的拒食活性[J]. 農藥，2007，46（12）：854-856.

[12]鄧志勇，鄧業成，劉艷華，等. 60種植物提取物對小菜蛾的殺蟲活性篩選[J]. 河南農業科學，2007，36（9）：57-60.

[13]嚴 偉. 抗稻瘟病菌植物源提取物組方研究[D]. 南昌：江西農業大學，2011.

[14]Saha S，Walia S，Kumar J，et al. Screening for feeding deterrent and insect growth regulatory activity of triterpenic saponins from Diploknema butyracea and Sapindus mukorossi[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（1）：434-440.

[15]周小燕，王德鳳，姜于蘭. 不同殺菌劑對柑橘煤煙病菌的室內毒力測定[J]. 南方農業學報，2011，42（9）：1062-1065.

[16]陳 立，徐漢虹，趙善歡. 應用均勻設計獲取復配農藥最佳增效配方[J]. 華南農業大學學報，2000，21（3）：33-35.

[17]張國權，呂小歡，羅志剛. 均勻設計的方法與應用[J]. 華南農業大學學報，1998，19（2）：91-96.

[18]李秀昌，韓曦英，孫 健. 利用DPS數據處理系統進行均勻試驗設計與分析[J]. 中國衛生統計，2010，27（2）：201-203.

[19]中華人民共和國農業農業部. 農藥室內生物測定實驗準則 殺菌劑 第6部分：混劑的聯合作用測定：NY/T 1156.1—2006[S]. 北京：中國標準出版社，2006.

[20]盛 姣. 十八烷基三甲基氯化銨對稻瘟病菌生物活性及作用機理研究[D]. 長沙：湖南農業大學，2006.

[21]孫漱沅. 水稻稻瘟病及其防治[M]. 上海：上海科學技術出版社，1986.

[22]國家質量技術監督局.農藥 田間藥效試驗準則（一） 殺菌劑防治禾谷類種傳病害：GB/T 17980.19—2000[S]. 北京：中國標準出版社，2000.

[23]黃 星. 水稻稻瘟病菌對三環唑的抗藥性研究[D]. 南京：南京農業大學，2002.

[24]車淑靜. 黑龍江省稻瘟病菌對稻瘟靈和三環唑的敏感性研究[D]. 大慶：黑龍江八一農墾大學，2008. 胡宗浩，方文婉，周曉彤，等. 黏質沙雷氏菌次生代謝產物殺滅松材線蟲效果[J]. 江蘇農業科學，2017，45（19）：183-186.endprint