基于量子點熒光層析試紙條法快速檢測三聚氰胺

趙弟萍, 程克文, 程 琳, 潘道東, 蔣 原,3

(1.合肥工業(yè)大學 食品科學與工程學院,安徽 合肥 230009; 2.寧波大學 海洋學院,浙江 寧波 315211; 3.江蘇出入境檢驗檢疫局 動植物與食品檢測中心,江蘇 南京 210001)

基于量子點熒光層析試紙條法快速檢測三聚氰胺

趙弟萍1, 程克文2, 程 琳1, 潘道東2, 蔣 原1,3

(1.合肥工業(yè)大學 食品科學與工程學院,安徽 合肥 230009; 2.寧波大學 海洋學院,浙江 寧波 315211; 3.江蘇出入境檢驗檢疫局 動植物與食品檢測中心,江蘇 南京 210001)

文章制備了水溶性量子點,建立了一種基于熒光量子點的側(cè)向?qū)游鲈嚰垯z測新方法,并將該方法用于食品中非法添加劑三聚氰胺的檢測。實驗結(jié)果表明,該熒光試紙條對三聚氰胺檢測的肉眼檢測限能達到10 ng/mL,檢測時間為10 min。該方法省時、快捷、經(jīng)濟,適合于三聚氰胺現(xiàn)場快速檢測。

三聚氰胺;量子點;免疫層析試紙條;快速檢測

0 引 言

三聚氰胺,化學名1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺,是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物,重要的氮雜環(huán)有機化工原料[1],工業(yè)上主要用作生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂的原料,此外還可作為阻燃劑、甲醛清潔劑、減水劑等[2]。目前所使用的“凱氏定氮法”[3]存在著無法測出氮來源的缺陷。通過添加三聚氰胺會使以凱氏定氮法測定的蛋白質(zhì)含量明顯提高,因而三聚氰胺常被不法商人用作添加劑添加到乳制品中以提升蛋白質(zhì)的含量指標[4]。三聚氰胺毒性輕微,但人體長期攝入,尤其是嬰幼兒,會造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害,膀胱、腎部結(jié)石,并可進一步誘發(fā)膀胱癌[5]。三聚氰胺對人體危害性很大,目前三聚氰胺的檢測也已成為乳制品檢測中的一項必檢項目。

量子點是一種半導體納米材料,通常是由鋅、鎘、硒、硫等元素化合而成的，三維尺寸均處于納米范圍內(nèi)的零維半導體材料,它的半徑小于或接近于激子玻爾半徑。眾所周知,當某種物質(zhì)的尺寸達到納米尺度時就會顯現(xiàn)出一些神奇的特性,量子點也是如此,由于小尺寸效應和量子效應的原因[6],當其受到光或電的刺激時,處于基態(tài)的載流子會被激發(fā)跳躍到更高的能級,等到這些載流子再回到原激發(fā)態(tài)時就會發(fā)出固定波長的可見光[7],故也稱量子點為半導體熒光納米晶粒。

用于生物分子標記[8]的半導體納米粒子要連接到生物分子上時必須要求是水溶性的,這可通過在其表面引入極性的官能團達到,實現(xiàn)量子點表面連接親水性的官能團再與生物材料相連可利用量子點表面的元素(如 Zn、Cd等)與巰基之間強的絡(luò)合作用力,使量子點與巰基酸絡(luò)合帶上羧基,巰基酸可以是巰基乙酸、巰基丁二酸、二巰基辛酸及巰基丙酸等。文獻[9]采用巰基丙酸(MPA)作為穩(wěn)定劑,直接在水溶液中合成了CdTe半導體納米粒子,并達到了表面帶有羧基的水溶性量子點直接標記生物分子的目的。利用表面修飾后的量子點與生物材料之間的靜電吸引作用可實現(xiàn)對生物材料大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白的熒光標記,并可用作激光掃描成像、免疫分析的熒光探針,是一種有效熒光示蹤工具[10]。量子點激發(fā)波長寬,發(fā)射波長窄、對稱,可用一種波長激發(fā)大小不同的同種量子點獲得豐富的標記顏色。如ZnS包裹的CdSe量子點,可得到10種不同的標記顏色[11]。本實驗在水溶性量子點合成的基礎(chǔ)上，將合成的量子點作為標記物進一步應用于熒光免疫層析試制條的研制,目的是借助量子點作為熒光標記材料,提高免疫層析試紙條的檢測靈敏度。

1 主要試劑與儀器

1.1 主要試劑

硒粉(純度99.8%)、巰基丙酸(MPA,純度99%)、硼氫化鈉(NaBH4)、2.5H2O氯化鎘(CdCl2·2.5H2O,純度99.99%)、HAuCl4(純度99.9%)、均購買于上海百靈威化學技術(shù)有限公司。蔗糖、海藻糖、羥基琥珀酰亞胺(NHS)、碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)、氯化鈉、氫氧化鈉、檸檬酸三鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、Tween 20、檸檬酸三鈉(分析純)、磷酸氫二鈉(分析純)、磷酸二氫鈉(分析純)氮氣、三聚氰胺標品(化學純)、牛血清白蛋白(BSA,純度大于98%)均購于國藥集團化學試劑有限公司,分析純均沒有進一步純化。三聚氰胺人工抗體、羊抗鼠二抗均由江蘇省出入境檢驗檢疫局提供。

1.2 主要儀器

AL104分析天平,Mettler Toledo公司;ZF-20D暗箱式紫外分析儀,鄭州豫華儀器制造有限公司;EOS600D,單反相機佳能光學設(shè)備有限公司;XYZ-3試紙條噴膜儀,Bio-Dot;CM-4000試紙條切條機,Bio-Dot。

2 試驗方法

2.1 量子點的制備

稱取390 mg Se粉,189 mg NaBH4,4 mL超純水,在密閉容器中密封反應(蓋子表面預留一個小孔以釋放反應過程中所產(chǎn)生的氣體)。將反應體系置于冰浴中反應24 h,得到前軀體溶液。最終將經(jīng)過24 h冰浴反應制得的前軀體避光放置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

稱量570 mg CdCl2·2.5 H2O于250 mL三頸燒瓶中,加入148 mL超純水,攪拌使其溶解。隨后向反應體系中加入0.5 mL巰基丙酸并用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)整個反應體系的pH值至7.5。最后反應體系在N2保護下,向其中迅速加入上述已制備好的前軀體上清液2 mL,繼續(xù)通N210 min后將上述溶液快速轉(zhuǎn)移到高壓反應釜中,在180 ℃條件下反應一定的時間。根據(jù)控制反應時間和反應溫度的長短得到不同粒徑即不同熒光發(fā)射波長的熒光量子點。

2.2 量子點與抗體偶聯(lián)復合物的制備

取50 μL水溶性CdSe羧基量子點于1.5 mL棕色離心管中,然后向其中加入5 μL 10mg/mL的EDC和10 μL NHS,隨之將整個混合液混合均勻后置于室溫下避光活化30 min后,再加入1 mg/mL三聚氰胺抗體6 μL,然后將加入抗體的混合液置于室溫下反應2～4 h,待反應充分后將最終得到的反應液置于4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?此反應液作為最終噴至于檢測線處的T線噴膜母液。

2.3 試紙條的組裝

將量子點與三聚氰胺抗體的偶聯(lián)復合物以7 μL/pad的量滴加到結(jié)合墊上制成熒光結(jié)合墊;將三聚氰胺包被原和羊抗鼠二抗以1 mg/mL、 0.4 μL/cm的噴速噴至于包被膜的檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線),作為最終的識別區(qū)域。

最終組裝成的試紙條有80 mm塑料黏性PVC底板,26 mm經(jīng)處理的樣品墊,5 mm經(jīng)處理過的熒光結(jié)合墊,25 mm硝酸纖維材質(zhì)的包被膜(NC膜)以及29 mm的吸水墊。在組裝時,它們依次相互銜接,銜接部分彼此壓約2 mm。

2.4 線性檢測

實驗過程中對三聚氰胺的定性分析是通過用肉眼觀測量子點暗場情況下在試紙條的檢測線(T線)處的顯色情況來確定的。進一步的定量檢測則是通過Image J軟件對檢測線(T線)處的峰面積灰度值進行掃面得來的。具體實驗方案如下:

(1) 樣品母液的配制。實驗過程中用于上樣的樣品母液是用PBS緩沖液溶解三聚氰胺固體,具體用天平稱取0.01 g三聚氰胺固體，然后將其溶解于10 mL pH=7.4 10 mmol/L 磷酸緩沖液。

(2) 樣品液的稀釋。將事先制備好的三聚氰胺母液用10 mmol/L pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液稀釋成1、2、5、10、50、100 ng/mL不同質(zhì)量濃度梯度的上樣液。

(3) 試紙條上樣。分別在組裝有熒光結(jié)合墊的試紙條上滴加80 μL不同質(zhì)量濃度梯度的上樣液,放置室溫避光3 h待包被膜完全干燥后放入紫外暗箱中用肉眼觀察在紫外激發(fā)下檢測線(T線)的出線情況，然后用單反相機拍攝暗場出線結(jié)果。

(4) 定量分析。將拍攝的暗場試紙條檢測線(T線)處的照片結(jié)果用Image J軟件進行峰面積灰度值掃描處理,并將最終得到的數(shù)據(jù)用Origin數(shù)據(jù)處理軟件進行處理分析，從而得到最終目標物的檢測限與檢測范圍。

(5) 標準曲線的建立。用制備好的試紙條檢測一系列已知質(zhì)量濃度的三聚氰胺;用Image J軟件掃描上述試紙條得到T、C線的灰度值,根據(jù)檢測線(T線)灰度值和三聚氰胺質(zhì)量濃度做出標準曲線。

2.5 特異性檢測

實驗過程中,為了保證除目標檢測液之外的實驗條件的一致性,采取同一批組裝好的試紙條、結(jié)合墊、稀釋緩沖液以及上樣步驟,分別對含有三聚氰胺、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、脫氧腺苷三磷酸(dATP)及其混合物的目標液進行檢測,具體實施步驟如下:

(1) 樣品液的稀釋。將三聚氰胺、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、脫氧腺苷三磷酸(dNTP)分別用0.01 mol/L pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液進行稀釋,其中三聚氰胺稀釋到50 ng/mL,賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、脫氧腺苷三磷酸(dNTP)稀釋到100 mg/mL,得到含有不同檢測物的稀釋上樣液,其中陰性對照(即空白組)采用磷酸緩沖液上樣。

(2) 試紙條上樣。分別在組裝有熒光結(jié)合墊的試紙條上滴加80 μL不同質(zhì)量濃度梯度的上樣液,放置室溫避光3 h待包被膜完全干燥后放入紫外暗箱中，用肉眼觀察在紫外激發(fā)下檢測線(T線)的出線情況，然后用單反相機拍攝暗場出線結(jié)果。

(3) 定量分析。將拍攝的暗場試紙條檢測線(T線)處的照片結(jié)果用Image J軟件進行試紙條檢測線(T線)的灰度值,并將最終得到的數(shù)據(jù)用Origin數(shù)據(jù)處理軟件進行處理分析，根據(jù)檢測線(T線)灰度值和檢測物的種類做出柱狀圖。

2.6 實際樣品檢測

針對模擬實際樣品檢測,本文采取從超市購買的新鮮牛奶,將其經(jīng)液相色譜確證陰性后,用于實際樣品檢測,具體實施方案如下:

(1) 取10 mL牛奶加入不同量的三聚氰胺標準樣,使牛奶中三聚氰胺添加量達到10、20、50、100 ng/mL,并分別編號為食品樣品 2、3、4、5號上樣液。

(2) 取新鮮牛奶樣品為食品樣品1號,作為空白對照。加入標樣處理1 h后,在4 ℃、4 000 r/min離心15 min后除去上層脂肪即可用于檢測。

(3) 試紙條上樣。分別在組裝有熒光結(jié)合墊的試紙條上滴加80 μL不同質(zhì)量濃度梯度的事先稀釋好的上樣液,待上樣過后的試紙條置于室溫條件下等其完全干燥之后，將其置于暗箱式紫外分析儀中進行觀察,然后拍攝暗場出線結(jié)果。

(4) 定量分析。將拍攝的暗場試紙條檢測線(T線)處的照片結(jié)果用Image J軟件進行峰面積灰度值掃描處理,并將最終得到的數(shù)據(jù)用Origin數(shù)據(jù)處理軟件進行處理分析，從而得到最終目標物肉眼檢測限。

3 結(jié)果分析

3.1 三聚氰胺檢測原理

傳統(tǒng)的基于膠體金標標記的試紙條根據(jù)反應原理可以分為夾心法試紙條和競爭法試紙條。本文在傳統(tǒng)的基于膠體金標記的試紙條檢測方法的基礎(chǔ)上,采用量子點作為熒光標記物研發(fā)出基于熒光量子點標記的熒光試紙條法來檢測食品中非法添加劑三聚氰胺,具體檢測原理如圖1所示。

該方法所采用的是競爭法試紙條檢測原理。在試紙條的熒光量子點標記的結(jié)合墊上固定具有識別功能的三聚氰胺識別抗體與量子點的偶聯(lián)復合物,在包被膜(NC)膜檢測線(T線)處固定有檢測目標物對應的包被原即三聚氰胺包被原,在質(zhì)控線(C線)處固定有識別抗體的二抗。檢測線(T線)處的三聚氰胺包被原其實與檢測目標物三聚氰胺是同一種物質(zhì),其可以競爭與量子點結(jié)合上的識別抗體的結(jié)合位點。檢測時,如果待測溶液中沒有目標檢測物三聚氰胺,結(jié)合墊上與量子點耦聯(lián)的識別抗體的結(jié)合位點就不會被待測液中的目標檢測物三聚氰胺所占據(jù),這樣與量子點結(jié)合的識別抗體就會與檢測線(T線)處的包被原所結(jié)合,此時檢測線(T線)處就能夠捕獲到量子點，從而在紫外暗箱中就可以觀測到熒光從而顯線。反之,如果待測溶液中有目標檢測物三聚氰胺存在,那么當待測溶液流過量子點標記的結(jié)合墊時，結(jié)合墊上與量子點耦聯(lián)的識別抗體就會與目標物檢測物結(jié)合,這樣結(jié)合墊上的識別抗體的識別位點就會被待測液中的目標檢測物所占據(jù)，從而就不能與檢測線(T線)處的三聚氰胺包被原結(jié)合,檢測線(T線)處就不能捕獲量子點,因此此時在紫外暗箱中觀察時整個試紙條檢測線(T線)處無熒光,繼而不能顯線。對于質(zhì)控線(C線)而言,無論待測溶液中有無目標檢測物,都可以在紫外暗箱中觀察到熒光線條,若C線沒有成功顯線,則說明試紙條檢測結(jié)果無效。

圖1 三聚氰胺檢測原理圖

3.2 量子點的表征

量子點之所以能發(fā)出不同顏色的熒光主要是由于量子點的量子效應。眾所周知,當某種物質(zhì)的尺寸達到納米尺度時就會顯現(xiàn)出一些神奇的特性,量子點也是如此。由于量子點粒徑很小,它的電子和空穴就會被量子限域,連續(xù)能帶變成具有分子特性的分立能級。當受到光或電的刺激時,處于低能級的載流子會被激發(fā)跳躍至更高的能級,等到這些載流子再回到低能級激發(fā)態(tài)時就會發(fā)出固定波長的可見光,即發(fā)射熒光。量子點的粒徑大小控制著它的熒光性能,不同大小的量子點具有不同的熒光光譜圖及發(fā)射不同顏色的熒光。本實驗制備的不同發(fā)射波長的量子點的熒光光譜圖如圖2所示。

從圖2b可以看出,本文所制備的5種量子點對應的波譜峰分別為500、545、570、605、625 nm,分別對應的顏色為綠色、黃綠色、黃色、橙色以及紅色。從制備的量子點的熒光光譜可以看出,其波譜譜峰呈對稱高斯分布,且其半峰寬除了500 nm處的綠色量子點外,其余均在30～35 nm,這與文獻報道的結(jié)果一致,與此同時也說明制備的量子點粒徑均一。

圖2 不同發(fā)射波長的量子點實物圖及熒光光譜圖

3.3 線性檢測結(jié)果分析

三聚氰胺定量檢測結(jié)果如圖3所示,其中圖3a為三聚氰胺定量檢測實物圖。

圖3 三聚氰胺線性檢測結(jié)果

從圖3可以看出，隨著三聚氰胺目標物質(zhì)量濃度提高,檢測線(T線)線條的熒光強度逐漸減弱,并且當目標物質(zhì)量濃度達到10 ng/mL時檢測線(T線)處基本觀察不到熒光線條,這說明檢測目標物質(zhì)量濃度在10 ng/mL達到基于競爭法原理檢測的消線值,即10 ng/mL為三聚氰胺的肉眼檢測限;從圖3b中可以看出隨著目標物質(zhì)量濃度的提高,檢測線(T線)處的峰面積越來越小,并且在10 ng/mL處峰面積基本為0,這與圖3a中檢測線(T線)的變化趨勢一致,進一步說明三聚氰胺肉眼檢測限為10 ng/mL。圖3c是根據(jù)圖3b處檢測線(T線)得到峰面積值擬合的線性曲線,從曲線的變化趨勢可以看出,隨著目標物質(zhì)量濃度的提高,檢測線(T線)的峰面積逐漸降低,這一變化趨勢符合競爭法試紙條檢測原理,故最終得到基于量子點熒光試紙條法檢測三聚氰胺的肉眼檢測限為10 ng/mL。

3.3 特異性檢測結(jié)果分析

試紙條對目標物檢測的特異性是免疫層析檢測技術(shù)中首要考慮的一個重要指標,也是評判一個檢測體系是否可靠的重要手段之一,只有通過特異選擇性的驗證才能保證最終檢測結(jié)果的準確性,從而避免因為物理性的非特異吸附或者化學性的同源性干擾而導致的假陽性結(jié)果。因此為了驗證該量子點熒光免疫層析試紙條對三聚氰胺檢測是否具有良好的特異性,本文分別選取以下幾種含有氨基的物質(zhì)來進行特異性的驗證。其中陰性對照采用磷酸緩沖液PBS,陽性對照采用賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)以及(dATP),其中三聚氰胺標品稀釋至50 ng/mL,賴氨酸、精氨酸、脫氧腺苷三磷酸(dATP)均稀釋至100 mg/mL。特異性檢測結(jié)果如圖4所示。

圖4 三聚氰胺特異性檢測

從圖4a中可以直觀看出,在紫外暗箱中,滴加了三聚氰胺檢測液的試紙條只出現(xiàn)了質(zhì)控線(C線),沒有出現(xiàn)檢測線(T線),其余幾組均出現(xiàn)了檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線),這說明50 ng/mL 檢測質(zhì)量濃度已經(jīng)完全達到基于競爭法檢測原理的消線值,故該質(zhì)量濃度處無檢測線(T線)出現(xiàn),而其余陽性對照組即使在其稀釋倍數(shù)為三聚氰胺稀釋倍數(shù)2 000倍的情況下依舊沒有消線,說明該方法對于陽性組的幾種物質(zhì)沒有識別能力。圖4b是根據(jù)圖4a中的檢測線(T線)處的峰面積值得出的特異性柱狀圖,從圖4b中可以看出,三聚氰胺檢測組的峰面積值遠小于其他檢測組的峰面積值,這進一步說明了該方法對三聚氰胺具有良好的選擇識別性。由此可以說明,本檢測方法不受其他氨基類化合物的干擾,具有極好的特異性,可用于實際樣品的檢測。

3.4 實際樣品檢測結(jié)果分析

在不同反應體系中檢測得到的結(jié)果如圖5所示,其中圖5a是定量檢測反應體系即磷酸緩沖液PBS反應體系,從圖5a中可以看出,其肉眼檢測限為10 ng/mL;圖5b 為模擬實際樣品檢測體系,即將不同量的三聚氰胺標準樣品加入牛奶中制成實際樣品檢測液上樣后得到的檢測結(jié)果,從圖5b中可以看出,實際樣品檢測液的肉眼檢測限為20 ng/mL,其肉眼檢測限比定量檢測體系的檢測限低,這主要是由于實際樣品檢測液的稀釋液相當于牛奶,而定量檢測體系的稀釋液是磷酸緩沖液,其成分較單一,后者成分較復雜。正由于稀釋體系的復雜化使得實際樣品檢測體系在檢測時受到稀釋液中其他復雜成分的干擾，從而使其檢測靈敏度降低,但是總體而言兩者檢測靈敏度相差不大,并且都能達到文獻[12]的標準因此說明該方法可以應用于實際樣品檢測。

圖5 三聚氰胺實際樣品檢測

4 結(jié) 論

傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術(shù)是以膠體金為標記物發(fā)展而來的一項快速檢測技術(shù)[13]。由于其具有高效性、快速性、簡便性,在現(xiàn)場篩查、高通量快速檢測中得以廣泛應用。但是由于膠體金粒徑比較大、金顆粒容易聚集,在檢測時有時無法達到要求的高靈敏度。

本實驗采用自制備水溶性量子點作為免疫層析試紙條中的標記物,研發(fā)出一種基于量子點的熒光免疫層析試紙條法，并將其用于非法添加物三聚氰胺的檢測。實驗對三聚氰胺進行了快速、定量、高靈敏的檢測,并對最終的檢測結(jié)果進行了分析,得出該熒光試紙條檢測三聚氰胺的肉眼檢測限能夠達到10 ng/mL,檢測時間只需10 min,同時結(jié)果表明該試紙條檢測具有良好的特異性。此外,這種新的檢測技術(shù)可以實現(xiàn)三聚氰胺現(xiàn)場檢測,有望在疾病的社區(qū)篩查中得到廣泛應用。

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QDs-basedfluorescenceimmunochromatographiclateralflowteststripsforrapiddetectionofmelamine

ZHAO Diping1, CHENG Kewen2, CHENG Lin1, PAN Daodong2, JIANG Yuan1,3

(1.School of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2.School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 3.Animal, Plant and Food Inspection Center， Jiangsu Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau， Nanjing 210001, China)

The synthesis of water-soluble quantum dots(QDs) was done and a new QDs-based fluorescence immunochromatographic lateral flow test strip detection method was established and then used to achieve the detection of illegal food additive: melamine. The experimental results showed that the detection limit for melamine by this strip was 10 ng/mL and the detection could be finished within 10 min. The strip is time-saving, easy to perform and relatively inexpensive. It is ideally suited for rapid on-site detection of melamine.

melamine; quantum dots(QDs); immunochromatographic test strip; rapid detection

2016-02-29；

2016-04-13

趙弟萍(1989-),女,甘肅蘭州人,合肥工業(yè)大學碩士生; 蔣 原(1982-),男,江蘇南通人,博士,合肥工業(yè)大學教授,博士生導師.

10.3969/j.issn.1003-5060.2017.10.023

R155.51

A

1003-5060(2017)10-1420-06

(責任編輯 閆杏麗)