扁桃斑鳩菊抗氧化活性成分的提取與篩選

黃曉穎，許振平，魏萬千，陳 璇，梁鈺儀，鄧慧華，馬 群，陳美珍

（汕頭大學理學院生物學系，廣東 汕頭 515063）

扁桃斑鳩菊抗氧化活性成分的提取與篩選

黃曉穎，許振平，魏萬千，陳 璇，梁鈺儀，鄧慧華，馬 群，陳美珍

（汕頭大學理學院生物學系，廣東 汕頭 515063）

目的 研究提取扁桃斑鳩菊（Vernonia amygdalina Del）葉中抗氧化活性成分的最佳工藝條件，并篩選活性最強的部位.方法 以DPPH自由基清除能力為響應值，利用響應面法優化提取條件；用不同極性有機溶劑對扁桃斑鳩菊乙醇提取物進行萃取分離，以DPPH自由基清除能力和還原能力為指標，篩選抗氧化活性最強部位.結果 響應面法優化的最優提取條件為：提取溫度58.5℃、乙醇體積分數62%和料液比1∶24，在此條件下，獲得的提取物DPPH自由基清除能力最強，理論預測值IC50為70.04 μg/mL，實際值IC50為（69.20±0.61）μg/mL，說明建立的模型可較好地描述該實驗中因素與指標的關系；各萃取部位的抗氧化能力大小依次為：正丁醇部位＞氯仿部位＞石油醚部位＞水相部位，其中正丁醇部位對DPPH自由基清除能力IC50為18.78 μg/mL，與乙醇提取物比較提高了2.68倍.結論 扁桃斑鳩菊體積分數為62%乙醇提取物的正丁醇萃取部位具有很強的抗氧化活性，值得進一步研究利用.

扁桃斑鳩菊；響應面法；抗氧化活性

扁桃斑鳩菊（Vernonia amygdalina Del）俗稱南非葉，原產于熱帶非洲，近年來從新加波、馬來西亞移植到中國.目前，在我國廣東、福建等地已有種植.扁桃斑鳩菊具有抗氧化、抗腫瘤等多種生理活性，其葉既可入藥，也可作為蔬菜食用.民間常用其治療乳腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肺癌、結腸癌等多種癌癥.在東南亞、臺灣等地民間使用較多[1].

對尼日利亞普遍食用的扁桃斑鳩菊的研究發現，其葉子含有抗壞血酸、木犀草素等多酚類物質，鮮葉自由基清除能力為（32.9±0.2）%[2].扁桃斑鳩菊的水提物、醇提物的氯仿、乙酸乙酯、正己烷、正丁醇部位對腫瘤細胞生長都有顯著抑制作用[3-6].然而，目前所見扁桃斑鳩菊的研究，其原料多限于國外種植的，而對引進種植于我國的扁桃斑鳩菊活性成分的研究未見報道.為此，本文開展對采集于中國廣東省的扁桃斑鳩菊葉子的抗氧化活性物質的研究，以期為扁桃斑鳩菊的進一步研究提供科學基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料 扁桃斑鳩菊新鮮葉片，采集于中國廣東省汕頭市.

1.1.2 試劑 1，1-二苯基-2-苦肼基（日本分裝進口，齊云生物技術有限公司）；無水乙醇，石油醚（60-90），氯仿，正丁醇，抗壞血酸（VC），FeSO4·7H2O，水楊酸，質量分數30%過氧化氫，十二水磷酸氫二鈉，二水磷酸二氫鈉，鐵氰化鉀，三氯乙酸，氯化鐵等，均為國產AR級.

1.2 儀器與設備

Universal 320R臺式冷凍離心機（德國Hettich公司）；FD-1C-50真空冷凍干燥器（上海比朗儀器有限公司）；旋轉蒸發器RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠）；高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；2100型UV-2100分光光度計（龍尼柯（上海）儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋HH-2（國華電器有限公司）；101-1型電熱鼓風干燥箱（江蘇省東臺市電器廠）.

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

扁桃斑鳩菊新鮮葉片洗凈，輕輕甩干水分，放置60℃干燥箱中烘干，粉碎、過40目篩，將粉末置于棕色瓶中保存備用.

1.3.2 抗氧化活性成分的提取

取扁桃斑鳩菊葉干粉，用乙醇溶液恒溫浸提，提取液離心分離，減壓濃縮，冷凍干燥得乙醇提取物.

1.3.3 乙醇提取的單因素實驗

據報道扁桃斑鳩菊活性成分主要為甾醇類化合物、皂苷、生物堿、多酚類、單萜、倍半萜類化合物和不飽和脂肪酸[1，7]等.因此，以乙醇為提取溶劑、以提取物對DPPH自由基半數清除濃度即DPPH·IC50為考察指標，在提取時間固定為120 min和其他條件不變的情況下進行單因素實驗，分別考察提取溫度、乙醇體積分數和料液比三個因素對乙醇提取物抗氧化活性的影響.

實驗方法：精確稱取5 g扁桃斑鳩菊葉粉末，在設定的條件下進行單因素提取實驗，提取物冷凍干燥后用蒸餾水配制成一定的濃度梯度，測定DPPH自由基清除率.通過SPSS 19.0統計分析軟件處理，得各提取條件下樣品的DPPH·IC50.

1.3.4 響應面法優化乙醇提取條件

在單因素試驗的基礎上，以提取溫度、乙醇體積分數、料液比三個變量為Box-Behnken設計的自變量，以三次實驗所得的DPPH·IC50平均值作為響應值（YDPPH），運用Minitab 15統計軟件進行實驗設計、數據分析及建立模型.響應面實驗設計見表1.

表1 響應面法實驗因素與水平

1.3.5 乙醇提取物的萃取分離

按1.3.4得到的最優提取工藝，提取獲得扁桃斑鳩菊乙醇提取液，利用旋轉蒸發儀除去乙醇得到乙醇浸膏，按乙醇浸膏與萃取劑1∶2體積比依次進行石油醚、氯仿、正丁醇分級萃取分離，得到乙醇提取物各萃取部位，將各萃取部位冷凍干燥48 h得干粉備用.

1.3.6 乙醇提取物活性部位的篩選

分別測定扁桃斑鳩菊乙醇提取物各萃取部位體外對DPPH自由基清除能力和對鐵離子的還原能力作為篩選指標.

1） DPPH自由基清除能力的測定

參考Capek.P等人[8]的方法進行.分別將樣品溶于水中配制成6個濃度梯度（20、40、80、160、320、640 μg/mL），在各試管中依次加入樣品溶液2 mL（空白管不加）、DPPH溶液（0.08 mg/mL）2 mL（本底管不加），各管用蒸餾水補足至4 mL，振蕩器混勻，室溫靜置30 min，在517 nm處以蒸餾水調零測定吸光度，得清除率.抗壞血酸（VC）作為陽性對照.計算公式如下：

式中：A空白為未加入樣品的DPPH溶液的吸光度；A實驗為DPPH溶液加入樣品的吸光度；A本底為未加入DPPH的樣品溶液的吸光度.

2） 還原能力的測定

參照Oyaizu M[9]的方法進行.分別取pH6.6磷酸緩沖液（PBS）和質量分數為1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，加入不同濃度的樣品液（0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL）1 mL，混勻，50℃水浴加熱20 min，迅速冷卻.加入質量分數為10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻，4000 r/min離心10 min.取上清液2.5 mL，加入質量分數為0.1%FeCl3和蒸餾水各2.5 mL，混勻，靜置10 min后，以蒸餾水調零、于700 nm波長處測定吸光度.抗壞血酸（VC）作為陽性對照.吸光度的大小即代表體系還原能力的大小[10].

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

考察了提取溫度、乙醇體積分數和料液比（m：v）三個因素對乙醇提取物DPPH自由基清除活性的影響，結果見圖1-3.

圖1 溫度對提取物 DHHP·IC50的影響

圖2 乙醇體積分數對提取物 DHHP·IC50的影響

圖3 料液比對提取物 DHHP·IC50的影響

從圖中可知，在單因素試驗中，當提取溫度60℃時，乙醇體積分數為60%，料液比1∶20，提取物對DPPH自由基清除活性最強，此時的DPPH·IC50最低.在此基礎上設計了響應面的因素水平進一步優化提取條件.

2.2 響應面實驗結果及分析

2.2.1 響應面實驗結果

響應面實驗結果見表2.

表2 乙醇提取Box-Behnken實驗結果

2.2.2 回歸模型顯著性檢驗

運用Minitab 15統計軟件分析實驗結果，得到二次多元回歸方程為：YDPPH＝71.604-1.161X1-1.391X2-7.267X3+6.162X12+4.526X22+9.621X32+1.315X1X2+6.613X1X3+ 0.461X2X3.

通過回歸方程方差分析結果考察模型的可靠性，結果如表3.結果顯示，回歸方差模型（P＝0.018＜0.05）顯著，失擬項（P＝0.150＞0.05）不顯著，說明模型是有效的.模型的決定系數R2為0.934 0，說明響應值的變化有93.40%來源于所選因素，因此，該回歸模型能很好地擬合所選因素與響應值的關系，可應用該模型對乙醇提取物DPPH自由基清除能力進行分析和預測.

表3 回歸模型方差分析

由表4回歸方程系數顯著性檢驗結果表明：一次項系數X3（P＜0.01）極顯著，X1和X2（P＞0.05）不顯著，平方項系數X12（P＜0.05）顯著，X32（P＜0.01）極顯著，而交叉乘積項系數除X1*X3外的P值均大于0.05為不顯著，說明提取溫度和料液比存在交互作用.結合表3得出，回歸模型線性顯著（P＜0.05），平方（P＜0.01）極顯著，交互作用不顯著（P＞0.05）.因此，所選因素與響應值之間并非是簡單的線性關系，對乙醇提取物DPPH自由基清除能力的影響大小依次為料液比（X3）＞乙醇體積分數（X2）＞提取溫度（X1）.

表4 回歸方程系數顯著性檢驗

2.2.3 響應曲面分析

通過回歸模型方程繪出3D響應曲面圖及2D等高線圖（見圖4），以此確定各個因素的最佳水平范圍.

圖4 各因素交互作用對提取物DPPH自由基清除能力IC50值的影響

由圖4A可知，在提取溫度55～65℃、乙醇體積分數55%～70%的條件下，對提取物的DPPH自由基清除能力有較強的影響；如圖4 C所示，乙醇體積分數在50%～70%、料液比在1∶15～1∶30的條件下，對提取物的DPPH自由基清除能力有較強的影響；從圖4 B可以看出，其等高線為橢圓形，故提取溫度和料液比這兩因素之間交互作用顯著.

通過Minitab 15軟件分析，得出扁桃斑鳩菊葉乙醇提取抗氧化成分最佳提取工藝條件是：提取溫度58.48℃、乙醇體積分數61.52%和料液比1∶24.34.在此條件下，得到的提取物具有最強的DPPH自由基清除能力，其DPPH·IC50理論值可達70.04 μg/mL.考慮實際的可操作性，將優化的提取條件修正為：提取溫度58.5℃、乙醇體積分數62%和料液比1∶24，在此條件下進行重復三次的驗證實驗，所得DPPH·IC50實際值為（69.20±0.61）μg/mL，與理論值相比，相對誤差為1.20%，說明回歸模型方程具有可行性，優選的工藝能有效地提取扁桃斑鳩菊葉的抗氧化活性成分.

2.2.4 乙醇提取物各部位抗氧化活性

1） 對DPPH自由基清除能力

分別測定了乙醇提取液不同濃度石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位、水相部位對DPPH自由基清除能力，結果見圖5.以SPSS 19.0軟件Probit回歸分析，置信區間為95%，獲得在一定的濃度梯度下各部位的DPPH·IC50（見表5）.

圖5 乙醇提取物各萃取部位對DPPH自由基清除能力

表5 各萃取部位的DPPH·IC50

由圖5可見，在一定作用濃度范圍內，各部位對DPPH自由基都具有較強清除活性，且存在濃度梯度效應.結合表5，可知各活性部位對DPPH自由基清除能力大小依次為正丁醇部位＞氯仿部位＞石油醚部位＞水相部位，其中正丁醇部位活性最強，其DPPH·IC50為18.778 μg/mL，清除能力接近陽性藥物抗壞血酸. 2） 還原能力的測定結果

分別測定了石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位、水相部位和抗壞血酸的還原能力，結果如圖6和圖7.

圖6 乙醇提取物各活性部位的還原能力

圖7 抗壞血酸的還原能力

由圖6可知，各活性部位的還原能力均隨著其濃度的增加而增強，其還原能力的大小依次為正丁醇部位＞氯仿部位＞石油醚部位＞水相部位，與1）中的清除DPPH自由基的實驗結果相似，說明提取物的抗氧化與還原能力呈正相關.當樣品質量濃度為0.4 mg/mL時，正丁醇部位的還原能力達0.483±0.021，是其他活性部位的3倍以上，但與圖7陽性藥物比較，仍弱于抗壞血酸.

實驗結果表明，正丁醇部位是扁桃斑鳩菊葉乙醇提取物的最強抗氧化活性部位.

3 討論

1） 通過響應面法優化扁桃斑鳩菊抗氧化活性物質的提取工藝條件為：提取溫度58.5℃、乙醇體積分數62%和料液比1∶24.在此條件下，提取120 min，得到的乙醇提取物DPPH·IC50為（69.20±0.61）μg/mL，與模型預測值70.04 μg/mL誤差較小，認為建立的實驗模型具有實際應用價值.

2） 檢測了乙醇提取物各有機相提取部位對DPPH自由基清除能力和對鐵離子的還原能力，得出各部位的抗氧化能力大小依次為：正丁醇部位＞氯仿部位＞石油醚部位＞水相部位.正丁醇部位顯示出最強抗氧化活性.Erasto P.等利用DPPH法等篩選扁桃斑鳩菊葉的丙酮、甲醇和水提取物的抗氧化活性，發現甲醇提取物表現出較強的DPPH自由基清除活性，其清除能力為75%～99.3%，強過丁基羥基甲苯，與兒茶酚類物質相當，而水提取物的活性最低[11]，這與本研究水提取物的抗氧化活性最低的結果相似.

3） 據文獻[2]扁桃斑鳩菊正丁醇部位主要含有倍半萜類、多糖類和黃酮類等，它們具有體外抗氧化和抗腫瘤活性.江燕從扁桃斑鳩菊葉醇提正丁醇部位分離鑒定出三個化合物，分別是丁二酸、Vemodalinol和木犀草苷[12].Erasto P等指出了扁桃斑鳩菊的抗氧化活性成分中Vemolide對DPPH自由基的還原能力比Vemodalol的強[13].然而，上述報道所用扁桃斑鳩菊原料均采集于尼日利亞或南非等國，而移植于我國南方的扁桃斑鳩菊其葉的化學組成是否發生變化？其抗氧化成分的種類與含量等尚待今后進一步分離鑒定等研究加以闡明.

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Study on Extracting and Screening Antioxidant Active Properties of Vernonia amygdalina Del

HUANGXiaoying,XUZhenping,CHENXuan,WEI Wanqian,DENG Huihua, LIANGYuyi,MAQun,ZHANG Yueling,CHENMeizhen*
（Department of Biology,College of Science,Shantou University,Shantou515063,Guangdong,China）

Objective:The optimum extraction process of antioxidant active properties ofVernonia amygdalinawasdetermined and the strongest antioxidant properties were screened as well.MethodsThe extract conditions were optimized bythe Response Surface Methodology,response value on DPPH radical scavenging ability.Different polar organic solvents were used to separate theVernonia amygdalinaethanol extract.Based on DPPH radical scavengingabilityand reducingpower,screening the strongest antioxidant properties.Results:At last the optimum conditions of extraction were determined as follows:extraction temperature 58.5℃,ethanol concentration 62%and solid-liquid ratio 1:24.Under the optimal extraction condition,the predictive maximum value of ethanol extract’s DPPH radical scavenging capacity was IC50＝70.04 μg/mL and the actual value was IC50＝（69.20± 0.61）μg/mL,indicating the model could well describe the relationship between the factors and indexes in the experiment.The antioxidant activities of different extracts were determined as follows: butanol fraction＞chloroform fraction＞petroleum ether fraction＞aqueous fraction.Butanol fraction has the strongest antioxidant activities（DPPH radical scavenging capacity,IC50＝18.778 μg/mL）, which has improved 2.68 times by comparing with the previous ethanol extract.Conclusion:The results showedthat the butanol fraction ofVernonia amygdalinafromthe 62%ethanol extraction had strongantioxidant activities,and deserves further study.

Vernonia amygdalina;response surface methodology;antioxidant activity

1001-4217（2017）04-0017-09

R284.2

A

2016-02-04

陳美珍（1956—），女，教授，研究方向為天然活性物質研究與開發.E-mail：chenmz@stu.edu.cn

2015年廣東省大學生科技創新培育專項資金重點項目