小分子抗腫瘤化合物SPH0396在不同種屬體內外代謝的比較

摘 要 目的：比較研究SPH0396在不同種屬的體內外代謝產物。方法：采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法（UPLC/Q-TOF MS），比較研究不同種屬肝微粒體中SPH0396的體外代謝產物，并進一步研究比格犬和食蟹猴分別灌胃給予SPH0396后血漿中的代謝產物。結果：SPH0396在體內外的代謝產物主要有N-去甲基代謝產物和氮氧化代謝產物。結論：SPH0396在猴的體內外代謝產物與人肝微粒體基本一致，該研究結果可為臨床前藥代和安全性評價的實驗動物選擇提供依據。

關鍵詞 代謝產物 SPH0396 肝微粒體 UPLC/Q-TOF MS 不同種屬

中圖分類號：R961 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2017）21-0070-06

Comparison of in vitro & in vivo metabolites of an anti-cancer small molecule SPH0396 in different species

XIANG Zhixiong*

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To compare in vitro & in vivo metabolites of SPH0396 in different species. Methods： An ultrahigh performance liquid chromatography/quadruple time-of-flight mass spectrometry （UPLC/Q-TOF MS） method was applied to identify the metabolites in vitro and in plasma after oral administration of 10 mg/kg SPH0396 to beagle dogs and cynomolgus monkeys. Results： The main metabolites of SPH0396 in vitro & in vivo were demethyl metabolites and N-oxidation metabolites. Conclusion： The main metabolites of SPH0396 in cynomolgus monkey are basically consistent with those in human liver microsomes. This result can provide basis for the selection of 1aboratory animals in preclinical evaluation of pharmacokinetics and safety of SPH0396.

KEy WORDS metabolite； SPH0396； liver microsome； UPLC/Q-TOF MS； different species

SPH0396是在我院設計的一系列Bcr-Abl抑制劑[1-7]化合物的基礎上優選出的一個化合物，其在分子、細胞和整體動物水平的有效性和安全性方面均接近或優于上市藥物Bosutinib[8-10]。在我院開展的一些藥代動力學實驗中，其在體外微粒體[11]、細胞[12-13]和整體動物[14]性質良好，因此將其作為候選化合物進一步研究。根據CFDA藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則[15]，本研究比較了SPH0396在不同種屬的肝微粒體中的代謝產物，并進一步比較了比格犬和食蟹猴分別灌胃給予10 mg/kg的SPH0396后血漿中的代謝產物，以便為臨床前藥物代謝和安全性評價中的非嚙齒類實驗動物的選擇提供依據。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑

SPH0396（批號270-74-D-6，純度99.695%，上海醫藥集團股份有限公司中央研究院合成）；混合人肝微粒體（批號34689）、混合雄性比格犬肝微粒體（批號74773）、混合雄性短尾猴肝微粒體（批號85158MU）、混合雄性SD大鼠肝微粒體（批號21027）和混合雄性CD-1小鼠肝微粒體（批號74759），均購自美國BD Gentest公司；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）（德國羅氏公司）；色譜純乙酸銨（純度99%，美國Tedia公司）；色譜純乙腈（德國Merck公司）；色譜純甲酸（德國Fluka公司）；超純水由Millipore公司純水機制備。比格犬2只，雄性，體重8～12 kg；食蟹猴2只，雄性，體重4～6 kg，分別由北京瑪斯生物技術有限公司和蘇州西山藥物研究有限公司提供。生產許可證號分別為SCXK（京）2011-0003和SCXK（蘇）2012-0009。

1.2 儀器

Triple TOF 5600+型四極桿飛行時間串聯質譜儀（配有電噴霧電離源（ESI源）和CDS自動校正系統，美國AB Sciex公司）；Acquity UPLC液相色譜系統（配有二元輸液泵、自動進樣器、柱溫箱、脫氣機和TUV紫外檢測器，美國Waters公司）；恒溫孵育器（美國Eppendorf公司）；labnet VX200振蕩器（美國labnet公司）；多管振蕩器（美國Fisher Scientific公司）；Thermo Heraeus X3R 冷凍離心機（美國Thermo Fisher公司）。

1.3 方法

1.3.1 體外肝微粒體溫孵方法和樣品的制備endprint

每個孵育體系總體積為100 μl，介質為100 mmol/L磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4），包括終濃度為3 μmol/L的SPH0396和0.5 mg/ml肝微粒體蛋白，采用37 ℃水浴進行孵育，預孵育3 min后，向緩沖液-底物-微粒體蛋白混合物中加入1 mmol/L的NADPH起始反應，反應60 min后加入同體積冰冷乙腈終止反應。所有孵育樣本均為雙樣本。

每一種屬肝微粒體孵育液取雙樣本各60 ml合并，渦流混合1 min，離心5 min（14 000 r/min），全取上清液，轉移至1.5 ml EP管中，40 ℃氮氣流下吹干，殘留物以120 ml乙腈-水（10∶90， v/v）溶解，取10 ml進行UPLC-UV/Q-TOF MS分析。

1.3.2 體內動物實驗方法和樣品的制備

健康雄性比格犬和食蟹猴各2只，試驗前禁食12 h，自由飲水，以10 mg/kg的劑量口服灌胃（給藥容積為2 ml/kg），采集給藥前（0 h）及給藥后2.0、6.0和24 h的血漿。

將猴或犬血漿樣品按時間點等體積合并，獲得每一種屬各時間點（0、2 、6 和24 h）合并血漿樣品。取200 ml樣品，加入400 ml乙腈，渦流混合1 min，離心5 min（14 000 r/min），全取上清液，轉移至1.5 ml EP管中，40 ℃氮氣流下吹干，殘留物以100 ml乙腈-水（20∶80， v/v）溶解，取7 ml進行UPLC/Q-TOF MS分析。

1.4 樣品檢測

色譜條件：色譜柱為Acquity TM HSS T3 C 18 柱（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm），美國Waters公司；流動相為含0.05%甲酸水溶液的5 mmol/L醋酸銨 （A）∶乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～1 min，A 95%；1～7 min，A 95%～50%；7～7.5 min，A 50%～1%；7.5～10 min，A 1%；10～10.3 min，A 50%～1%；10.3～15 min，A 95%；柱溫為40 ℃；流速為0.45 ml/min；UV檢測波長為280 nm。

質譜條件：電噴霧電離源（ESI），正離子掃描（高靈敏度模式）方式檢測，GAS1：60 psi，GAS2：60 psi，Current GAS：40 psi，源溫度為550 ℃，離子噴霧電壓（ISVF）為5 500 V，去簇電壓80 eV，一級全掃描時碰撞能量為10 eV，二級全掃描時碰撞能量為30 ± 10 eV，掃描范圍為m/z 100～700，采用自動校正系統（CDS）外標法校正質量數。

采用AB Sciex公司的Analyst？ TF V1.6和Waters公司的Masslynx V4.1軟件進行數據采集，采用AB Sciex公司的PeakView？ V1.2和MetabolitePilot V1.5軟件進行數據分析。

2 結果

2.1 SPH0396對照品質譜分析

在一級全掃描質譜圖中，獲得m/z 553.162 7的準分子離子（[M + H]+）及m/z 555.160 4（[M + H + 2]+）和557.159 6（[M + H + 4]+）的氯同位素離子，三者豐度比約為9∶6∶1，在產物離子掃描模式下，獲得主要碎片離子為m/z 453.062 0、389.089 4和101.108 3。

2.2 體外代謝產物分析

M1：從MDF色譜圖中選擇性檢測m/z 521.182 0，在保留時間5.18 min處檢測到1個色譜峰，在一級全掃描質譜圖中，獲得m/z 521.180 9的準分子離子（[M+ H]+）及m/z 523.180 2（[M + H + 2]+）的氯同位素離子，二者豐度比約為3∶1，提示分子中含有1個氯原子，根據準確質量信息，推測M1的分子式為C27DH25N5O4Cl，與原形藥物相比減少CHCl，增加1個O原子；在產物離子掃描模式下，獲得主要碎片離子為m/z 435.096 8和371.123 0，推測M1為原形藥物氧化脫氯并N-去甲基代謝產物。

M2：從MDF色譜圖中選擇性檢測m/z 525.131 0，在保留時間6.20 min處檢測到1個色譜峰，在一級全掃描質譜圖中，獲得m/z 525.131 7的準分子離子（[M + H]+）及m/z 527.129 2（[M + H + 2]+）和529.133 6（[M + H + 4]+）的氯同位素離子，三者豐度比約為9∶6∶1，根據準確質量信息，推測分子式為C26DH22N5O3Cl2，與原形藥物相比減少C2H4；在產物離子掃描模式下，獲得主要碎片離子為m/z 439.045 1，較原形藥物碎片離子453.062 0減少14，推測M2為原形藥物N-去甲基并O-去甲基代謝產物。

M3：從MDF色譜圖中選擇性檢測m/z 535.196 0，在保留時間5.26 min處檢測到1個色譜峰，在一級全掃描質譜圖中，獲得m/z 535.197 2的準分子離子（[M + H]+）及m/z 537.194 4（[M + H + 2]+）的氯同位素離子，二者豐度比約為3∶1，提示分子中含有1個氯原子，根據準確質量信息，推測M3的分子式為C28DH27N5O4Cl，與原形藥物相比減少Cl，增加OH；在產物離子掃描模式下，獲得主要碎片離子為m/z 435.096 5和371.123 3，推測M3為原形藥物氧化脫氯代謝產物。

M4：從MDF色譜圖中選擇性檢測m/z 537.173 0，在保留時間4.36和4.99 min處檢測到2個色譜峰，在一級全掃描質譜圖中，獲得m/z 537.174 5的準分子離子（[M + H]+）及m/z 539.173 4（[M + H + 2]+）的氯同位素離子，二者豐度比約為3∶1；產物離子掃描質譜圖中主要檢測到435.095 6碎片離子；根據準確質量信息，推測M4-1和M4-2的分子式為C27DH25N5O5Cl，與M1相比增加1個O原子，推測M4-1和M4-2為M1哌嗪環單氧化代謝產物。endprint

M5-1：從MDF色譜圖中選擇性檢測m/z 539.146 0，在保留時間6.30處檢測到1個色譜峰，在一級全掃描質譜圖中，獲得m/z 539.147 8的準分子離子（[M + H]+）及m/z 541.144 6（[M + H + 2]+）和543.142 8（[M + H + 4]+）的氯同位素離子，三者豐度比約為9∶6∶1，根據準確質量信息，推測分子式為C27DH24N5O3Cl2，與原形藥物相比減少CH2；在產物離子掃描模式下，獲得主要碎片離子為m/z 439.046 5，較原形藥物碎片離子453.062 0減少14，推測M5-1為原形藥物O-去甲基代謝產物。

M5-2：從MDF色譜圖中選擇性檢測m/z 539.146 0，在保留時間6.92 min處檢測到1個色譜峰，在一級全掃描質譜圖中，獲得m/z 539.148 3的準分子離子（[M + H]+）及m/z 541.145 7（[M + H + 2]+）和543.143 2（[M + H + 4]+）的氯同位素離子，三者豐度比約為9∶6∶1；在產物離子掃描模式下，獲得主要碎片離子為m/z 453.062 6，M5-2與N-去甲基代謝產物對照品溶液具有相同的色譜和質譜行為，確定其為SPH0396的N-去甲基代謝產物。

M6：從MDF色譜圖中選擇性檢測m/z 551.189 0，在保留時間4.53和5.44 min處檢測到2個色譜峰，在一級全掃描質譜圖中，獲得m/z 551.191 2的準分子離子（[M + H]+）及m/z 553.190 6（[M + H + 2]+）的氯同位素離子，二者豐度比約為3∶1，產物離子掃描質譜圖中主要檢測到435.096 3碎片離子；根據準確質量信息，推測M6-1和M6-2的分子式為C28DH27N5O5Cl，與M3相比增加1個O原子；推測M6-1和M6-2為M3的甲基哌嗪環單氧化代謝產物。

M7-1：從MDF色譜圖中選擇性檢測m/z 555.144 0，在保留時間6.10處檢測到1個色譜峰，在一級全掃描質譜圖中，獲得m/z 555.144 4的準分子離子（[M + H]+）及m/z 557.139 8（[M + H + 2]+）和559.138 7（[M + H + 4]+）的氯同位素離子，三者豐度比約為9∶6∶1，根據準確質量信息，推測分子式為C27DH24N5O4Cl2，與M5-2相比增加1個O原子；在產物離子掃描模式下，獲得主要碎片離子為m/z 453.061 1與M5-2相同，推測M7-1為M5-2哌嗪環單氧化代謝產物。

M7-2：從MDF色譜圖中選擇性檢測m/z 555.144 0，在保留時間6.45 min處檢測到1個色譜峰，在一級全掃描質譜圖中，獲得m/z 555.140 8的準分子離子（[M + H]+）及m/z 557.140 1（[M + H + 2]+）和559.139 0（[M + H + 4]+）的氯同位素離子，三者豐度比約為9∶6∶1；在產物離子掃描模式下，獲得主要碎片離子為m/z 439.044 8，與M5-1相同，推測M7-2為M5-1甲基哌嗪環單氧化代謝產物。

M8：從MDF色譜圖中選擇性檢測m/z 569.158 0，在保留時間6.33和7.18 min處檢測到2個色譜峰，分別命名為M8-1和M8-2，在M8-1的一級全掃描質譜圖中，獲得m/z 569.157 7的準分子離子（[M + H]+）及m/z 571.155 8（[M + H + 2]+）和573.151 4（[M + H + 4]+）的氯同位素離子，三者豐度比約為9∶6∶1，根據準確質量信息，推測分子式為C28DH26N5O4Cl2，與原形藥物相比增加1個O原子；在產物離子掃描模式下，獲得主要碎片離子為m/z 453.061 0，與原形藥物相同，推測M8-1為原形藥物甲基哌嗪環單氧化代謝產物。在M8-2的一級全掃描質譜圖中，獲得m/z 569.158 4的準分子離子（[M + H]+）及m/z 571.156 0（[M + H + 2]+）和573.154 5（[M + H + 4]+）的氯同位素離子，三者豐度比約為9∶6∶1；在產物離子掃描模式下，獲得主要碎片離子為m/z 453.061 8，M8-2與N-氧化代謝產物對照品溶液具有相同的色譜和質譜行為，確定其為SPH0396的N-氧化代謝產物。

M9： 從MDF色譜圖中選擇性檢測m/z 585.153 0，在保留時間6.19 min處檢測到1個色譜峰，一級全掃描質譜圖中，獲得m/z 585.153 8的準分子離子（[M + H]+）及m/z 587.153 5（[M + H + 2]+）和589.151 1（[M + H + 4]+）的氯同位素離子，三者豐度比約為9∶6∶1，根據準確質量信息，推測分子式為C28DH26N5O5Cl2，與M8-1相比增加1個O原子；在產物離子掃描模式下，獲得主要碎片離子為m/z 453.061 0，與M8-1相同，推測M9為原形藥物甲基哌嗪環雙氧化代謝產物。

2.3 SPH0396在不同種屬肝微粒體中的代謝產物

SPH0396在五種屬肝微粒體中均不穩定，孵化60 min后，在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒體中分別有68.9%、84.5%、96.9%、47.4%和58.4%的原形藥物發生氧化代謝，代謝過程均為NADPH依賴。推測的SPH0396在各種屬肝微粒體中的代謝產物信息見表1和2，代謝途徑見圖2。

2.4 SPH0396在比格犬和食蟹猴血漿中的代謝產物

利用MetabolitePilot軟件對給藥后的比格犬和食蟹猴血漿樣品數據進行處理，代謝產物命名同肝微粒體代謝種屬比較試驗。原形藥物和代謝物的相關信息見表3，代謝途徑見圖3。endprint

3 討論

在人肝微粒體中主要代謝途徑為氧化脫氯、甲基哌嗪環N-氧化及N-去甲基。從代謝產物種類和相對含量比較，大鼠、小鼠、猴和人具有相似的代謝物譜。犬肝微粒體中主要代謝途徑為甲基哌嗪環N-氧化，與人肝微粒體代謝物譜有較大差異。

給藥后的食蟹猴血漿中主要檢測到原形藥物，檢測到少量的N-去甲基代謝產物M5-2、甲基哌嗪環氮氧化代謝產物M8-2以及氧化脫氯代謝產物M3。給藥后的比格犬血漿中主要檢測到原形藥物，檢測到的代謝產物有 N-去甲基代謝產物M5-2和甲基哌嗪環氮氧化代謝產物M8-2，與原形藥物質譜峰面積比略高于食蟹猴血漿。猴肝微粒體中主要代謝產物氧化脫氯代謝物M3在猴血漿中可檢測到，但質譜峰面積小于原形藥物的0.5%，在犬血漿中未檢測到。

從各種屬肝微粒體代謝產物種類和相對含量比較，主要代謝物甲基哌嗪環氮氧化（M8-2）在猴微粒體中情況與人更接近；從體內SPH0396灌胃給藥后在比格犬和食蟹猴血漿中的代謝產物看，甲基哌嗪環氮氧化（M8-2）在比格犬血漿中偏多，原型藥物在比格犬體內的半衰期比食蟹猴體內的短，原型藥物在食蟹猴體內暴露更充分。研究結果表明SPH0396在食蟹猴體內的表現情況更接近于人，所以SPH0396臨床前藥代和安全性評價的實驗動物可以選擇食蟹猴作為人代謝性質相近的非嚙齒類動物。

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