磁共振灌注成像在鼠肝纖維化、肝硬化病理分級中的價值

王國光， 孟令平， 胡明秀， 洪玉萍， 官兵， 喬偉偉

·實驗研究·

磁共振灌注成像在鼠肝纖維化、肝硬化病理分級中的價值

王國光， 孟令平， 胡明秀， 洪玉萍， 官兵， 喬偉偉

目的分析大鼠肝纖維化、肝硬化磁共振灌注成像(MR-PWI)參數特征，評價PWI對肝纖維化、肝硬化病理分級的價值。方法清潔級SD大鼠100只，體重約150～200 g，雄性。將大鼠隨機分為2組，對照組(n=16)，實驗組(n=84)；實驗組腹腔定點注射硫代乙酰胺(TAA)，對照組同期腹腔注射相同劑量生理鹽水。建模成功后實驗組和對照組分批次進行肝臟常規磁共振掃描及PWI掃描。依據病理結果將肝臟損傷分為5組：肝纖維化0期(對照組)、肝纖維化Ⅰ期(S1)，肝纖維化Ⅱ期(S2)，肝纖維化Ⅲ期(S3)，肝硬化結節期(S4)，然后分析灌注參數與病理分級的相關性。結果共69只大鼠(實驗組57只，對照組12只)成功獲取PWI圖像并進行灌注參數測量，成功率69%(69/100)。各期門靜脈諸灌注參數之間差異有統計學意義(Plt;0.05)，各期肝實質諸灌注參數之間差異有統計學意義(Plt;0.001)。門靜脈TTP及WOR與肝纖維化分級之間存在相關性(r=0.420、-0.464，Plt;0.001)。肝實質TTP及WIR與肝纖維化分級之間存在相關性(r=0.424、-0.488，Plt;0.001)。結論MR-PWI參數與大鼠肝纖維化、肝硬化的分級有一定相關性。MR-PWI對評價肝纖維化分期具有一定的臨床價值。

灌注加權成像； 肝纖維化； 肝硬化； 動物模型

肝纖維化是引起肝功能障礙和肝硬化的病理基礎，早期診斷尤為重要。磁共振灌注加權成像(magnetic resonance perfusion weighted imaging，MR-PWI)能夠反映組織微血管灌注和血液動力學情況，已較廣泛用于肝臟病變的實驗與臨床研究[1]，但其灌注參數還沒有統一的定量標準。本實驗采用藥物誘導大鼠肝損傷模型，以半定量方式，探討肝纖維化、肝硬化磁共振灌注參數的意義及其與肝纖維化分級的相關性。

材料與方法

1.實驗動物與分組

選用純系清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠共100只，鼠齡6～7周，均為雄性，體重約180～200 g。大鼠均由上海睿太莫斯生物科技有限公司提供，在上海農林職業技術學院動物實驗中心標準飼養。大鼠隨機分為兩組：實驗組(n=84)，劑量200 mg/kg，經腹腔注射硫代乙酰胺(TAA，上海凌峰化學試劑有限公司提供)，3次/周，連續7周，第8周始，藥物增加20%，連續至第17周；第18周始，視大鼠狀態再次增量20%，連續至第30周。對照組(n=16)， 正常喂飼同量生理鹽水，腹腔注射，3次/周。

圖1 對照組。a) 鼠肝大體標本，質地光滑柔軟； b) 病理切片(HE，×400)。圖2 肝纖維化器。a) 鼠肝大體標本，肝臟標明不光澤，未見明顯結節樣改變； b) 肝細胞脂肪變性，肝小葉近中央靜脈處肝細胞中-重度水變性，氣球樣變，匯管區纖維組織增生(HE，×400)。 圖3 肝硬化期。a) 鼠肝大體標本嗎，可見肝質地毛糙，肝硬化結節突出于肝表面； b) 鼠肝DN有纖維隔，假小葉形成，部分肝細胞異型性變(HE，×400)。

2.大體觀察

在實驗過程中，觀察大鼠活性、激惹度及死亡情況；建模第6周開始至30周，分批次取大鼠進行MRI檢查，深度麻醉后處死大鼠，動態觀察肝臟的形態及結構變化，并作組織染片觀察(圖1～3)。

3.MRI檢查

采用Philips Achivel 1.5T超導型磁共振成像儀，小動物專用線圈(內徑3英寸正交線圈)，腹腔注射10%水合氯醛麻醉(2 mg/kg)，俯臥于線圈中央，頭先進，采用加壓包扎法(棉紗布包裹)減少呼吸動度從而減少呼吸偽影。試驗組大鼠(6±1)～(30±1)周后批次(1～5只/次)、對照組同期(1～2只/次)行磁共振常規橫軸面T1WI、壓脂T2WI(圖4)和冠狀面壓脂T2WI掃描后，進行PWI掃描：抑脂THRIVE(3D T1-TFE)序列，翻轉角10°，TR 7.5 ms，TE 3.7 ms，矩陣128×128，采集次數1，層厚2.0 mm，層間隔2 mm。全肝掃描10層，55個時相，掃描時間120 s。由鼠尾靜脈團注對比劑Gd-DTPA(0.05 mmol/kg，北陸藥業)，注射對比劑同時開始PWI掃描。原始灌注圖像傳入后處理工作站，采用Basic-T1-Perfusion軟件包進行后處理，選擇腹主動脈、門靜脈和肝實質作為興趣區(ROI)，自動繪制時間-信號強度曲線(time-signal intensity curve，TIC)及偽彩圖(圖5～6)。觀察并記錄：①達峰時間(time to peak，TTP)，ROI信號強度開始升高到升為峰值時刻之間的時間，即T0到達峰值強度時間(T1)之間的時間，是反映血管阻力的指標；②流入速率(wash in rate，WIR)，T0與峰值強度時間T1之間的最大斜率，為門靜脈血流灌注曲線評價指標，可以直接反映微循環血流量；③流出速率(wash out rate，WOR)，峰值強度時間T1和測量末端之間的最大斜率。

4.病理組織學檢查

全麻下剖腹取肝，按照MRI檢查時所做橫斷切面取病理標本切片，厚度約4 mm，切片做HE染色，兩位病理醫師鏡下觀察肝臟纖維化情況。按文獻[2]判斷肝纖維化程度：0級，無成纖維細胞增生，膠原纖維量正常；Ⅰ級，匯管區擴大，少量成纖維細胞增生，膠原纖維輕度增生；Ⅱ級，匯管區內成纖維細胞增生，膠原纖維呈條狀延伸；Ⅲ級，匯管區內成纖維細胞大量增生，膠原纖維形成小葉纖維隔；Ⅳ級，伴肝硬化假小葉形成；肝硬化結節期，大體觀彌漫性肝結節(直徑gt;2 mm)。

圖4 肝硬化組，大鼠肝臟邊緣不光整，各葉比例失調，肝實質信號不均。a) T1WI； b) T2WI。圖5 a) S0期TIC曲線； b) 肝硬化期TIC曲線。 圖6 a) S0期PWI偽彩圖； b) 肝硬化期PWI偽彩圖。

參數S0S1-2S3S4χ2值PTTP(s)60．82(47．92，73．72)87．27(66．32，98．61)83．77(65．45，94．25)73．30(62．83，97．74)15．0140．002WIR(L/s)269．39±81．38268．94±111．1262．26±99．19216．54±113．172．679?0．049WOR(L/s)40．88(30．70，67．72)56．10(45．18，136．21)73．02(40．89，104．00)34．62(18．40，66．11)20．0580．000

注：由于S1、S2期病例數較少，所以并為一組進行統計學分析；*采用單因素方差分析。

5.統計學分析

使用SPSS 19.0統計學軟件包對數據進行統計學處理。首先對灌注數據結果進行方差齊性檢驗及正態性檢驗(單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗)，對不符合正態分布的數據結果用中位數(四分位數)表示，采用非參數檢驗(Kruskal-Wallis檢驗)分析，對符合正態分布的數據結果進行單因素方差分析；各灌注參數與病理分級相關性，采用Spearman相關分析。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

結果

1.動物觀察及病理分型

大鼠飼養過程中，對照組16只，15只存活；實驗組84只中，MRI檢查前、后大鼠死亡15只，死亡率為17%。病理診斷(圖1～3)肝纖維化0期(S0期)15只(共12只成功進行MR-PWI檢查并后處理生成TIC曲線)；肝纖維化Ⅰ期(S1)8只(7)，肝纖維化Ⅱ期(S2)10只(8)，肝纖維化Ⅲ期(S3)30只(24)，肝纖維化Ⅳ期(S4)21只(18)。

2.MR-PWI表現

共69只大鼠成功獲得較滿意肝灌注圖像(圖5～6)。主動脈灌注曲線形態呈驟升驟降型，分為升段、降段及水平段，水平段呈不規則鋸齒樣來回波動，肝纖維化各期之間差異無統計學意義。對照組門靜脈灌注曲線呈速升速降型，峰值出現時間較主動脈遲，幅度較主動脈小，降段亦可見小幅鋸齒樣波動；肝實質灌注曲線穩定，波動小，動脈期上升緩慢，門靜脈期上升較快并達峰值，降段緩慢；肝纖維化期及肝硬化結節期大鼠門靜脈灌注曲線呈速升緩降型，峰值出現時間較主動脈晚，幅度小；肝實質灌注曲線穩定，波動小，動脈期上升緩慢峰值不明顯，下降緩慢。

3.門靜脈灌注參數變化

對照組門靜脈TTP低于肝纖維化各期，差異有統計學意義(Plt;0.05，表1)。門靜脈WIR隨著肝纖維化進展呈下降趨勢，差異有統計學意義(Plt;0.05)，其中S4期下降最明顯。門靜脈WOR在S4期低于其余各期，差異有統計學意義(Plt;0.001)。

表2 肝臟纖維化-硬化模型肝實質灌注參數測量結果

4.肝實質灌注參數

肝實質TTP隨著肝纖維化的進展逐漸增加，差異有統計學意義(Plt;0.001，表2)。肝實質WIR肝硬化結節期低于其余各期，差異有統計學意義(Plt;0.001)。肝實質WOR隨著肝纖維化進展而逐漸降低，差異有統計學意義(Plt;0.001)。

5.MR-PWI與肝纖維化-硬化分級的相關性

門靜脈TTP與肝纖維化分級間呈輕度相關(r=0.420，Plt;0.001)，肝實質TTP與肝纖維化分級間呈輕度相關(r=0.424，Plt;0.001)；門靜脈WOR與肝纖維化分級間存在相關性(r=-0.464，Plt;0.001)；肝實質WIR與肝纖維化分級間存在相關性(r=-0.488，Plt;0.001)，見表3。門靜脈WIR及肝實質WOR與肝纖維化-硬化分級之間的相關系數過低，盡管Plt;0.001，實驗結果仍認為門靜脈WIR及肝實質WOR與肝纖維化-硬化分級之間不存在相關性。

表3 肝臟纖維化-硬化模型灌注參數與肝纖維化分級相關性

討論

肝纖維化是肝臟損傷后，多種細胞外基質過度沉積，纖維化增生，影響肝臟功能的過程[3]，以纖維組織大量增生、肝膽管變形或炎癥、肝小葉結構無序化為特征。在肝纖維化進程中，肝臟整體及局部的血液動力學均發生變化，并出現肝動脈緩沖反應，即肝門靜脈供血逐漸減少，并通過門體分流繞過肝臟實質，而肝動脈血流逐漸增多，以抵消門靜脈血流減少的影響[4]。另外，結締組織廣泛增生，肝血竇閉塞及竇周纖維化，假小葉形成及纖維結締組織壓迫小葉下靜脈，同時部分肝動脈小分支與門靜脈小分支在匯入肝竇前異常吻合，導致肝門靜脈壓力逐步增高。所以，伴隨著纖維化、炎性反應的進展以及血液動力學的改變，肝臟組織的微循環代謝障礙逐漸顯現[5-6]。

PWI可以觀察肝臟微循環血流動力學變化，同時可以對組織活性和功能進行評價。依據成像原理，PWI可大致分為3種類型：①對比劑首過灌注，分兩種：T1加權動態對比增強磁共振成像(DCE-MRI)，對血管外細胞外間隙內對比劑較敏感，能夠反應微血管灌注、滲透性及血管外細胞外間隙大小等情況；T2/T2*加權動態磁化率對比度成像(DSC-MRI)，對血管內對比劑較敏感，可反應組織灌注、血容量等情況[7]。②動脈血質子自旋標記技術(arterial spin labeling，ASL)，利用血流內水分子自旋標記技術來觀察微循環灌注情況。③血氧水平依賴的磁共振功能成像(BOLD-fMm)，是PWI中的新領域[8]。在MR-PWI中，目前最常用的是第一種方法，經靜脈團注對比劑，而后采用快速掃描序列進行連續多層面、多次成像，獲得一系列動態圖像，目前較常用的序列是3D擾相梯度回波序列，它能夠排除射頻脈沖剖面作用導致的錯誤，具有較高的信噪比，同時應用敏感編碼(sensitivity encoding，SENSE)技術，可以明顯提高PWI的時間和空間分辨力。本研究以TAA誘導的大鼠肝纖維化、肝硬化模型為實驗對象，采用對比劑團注示蹤法進行檢查，該方法能夠反映組織血液灌注情況，從而間接評價組織微血管分布情況[9-11]。 在本實驗中，門靜脈的TTP及肝實質的TTP均與肝纖維化分期呈輕度正相關，門靜脈的WOR及肝實質的WIR均與肝纖維化分期呈輕度負相關，與文獻報道一致[12]，提示門靜脈及肝實質的TTP、WIR、WOR等灌注參數作為MR-PWI分析的重要指標，可反映門靜脈壓力改變和肝實質灌注變化趨勢。

正常肝組織主要由門靜脈供血，肝臟TIC曲線呈緩升緩降特點，隨著肝纖維化、肝硬化的進展，TIC曲線也逐漸出現速升緩降變化[13]。灌注參數可以從不同角度反映肝組織血流灌注情況：WIR代表由血管增強開始到增強峰值的斜率，WOR代表由血管增強峰值到第一循環結束時的斜率，兩者都是單位時間內對比劑流入或流出引起組織信號升高或降低速度的改變，其變化程度受組織內對比劑濃度、血管通透性及血流速度等多項因素影響[2,14-16]。肝實質TTP代表血漿內低分子量化合物(一般指順磁性對比劑，如GDPA)自由進入肝Disse腔間隙的能力。本研究發現隨著肝纖維化進展肝實質的TTP逐漸延長，可能是由于肝纖維組織增生以及假小葉形成造成肝血流異常，不成對的小動脈增多，肝竇毛細血管化以及竇后阻塞等，導致血管狹窄、閉塞，血流減慢，同時沉積在血管外間隙及Disse腔的膠原限制了化合物的移動，而小分子釓劑雖然能夠通過變形的肝竇，但它在血管外間隙的擴散減慢，故肝纖維化組肝實質TIC呈波形低平，TP延長的特點[17]。WIR隨著肝纖維化的進展逐漸遞減，也反映肝實質灌注的下降趨勢，但是肝纖維化早期及晚期組肝臟WIR與S0期WIR差異不明顯，原因可能是此階段肝纖維化的程度較輕，門脈血流阻力上漲幅度較小，肝臟可以通過自身的調節機制來補償肝臟的血流灌注。肝硬化結節期肝實質灌注量明顯下降，WIR下降較明顯，可能是由于隨著肝纖維化的進展，大量膠原纖維沉積、肝小葉結構破壞及重構、肝硬化假小葉形成，壓迫肝血竇[18]，同時肝竇內皮下基底膜形成，誘導肝竇毛細血管化，導致肝竇的滲透減壓作用降低，肝硬化結節期出現新生及不成對血管，并形成較多閉塞血管及膽管纖維瘢痕[19]，這些都導致肝臟微循環阻力增高， 肝實質灌注下降。

通過對大鼠肝纖維化模型的初步研究表明，PWI通過觀察肝臟血流灌注的變化，較準確地反映肝纖維化肝實質灌注下降和門靜脈壓力增高的血流動力學變化趨勢，從而間接地反映了肝纖維化的發展過程及嚴重程度。作為一種無創性灌注測量技術，能夠對不同階段肝纖維化及肝硬化進行判斷，有較好的應用前景和臨床應用價值。但由于肝臟組織結構與雙血供特點及肝臟灌注數學模型的復雜性，目前肝臟灌注血流精確定量尚未得到廣泛應用。本實驗受到檢查設備軟件限制，僅僅半定量分析了灌注參數TTP、WIR、WOR在不同時期肝纖維化、肝硬化中的數值變化[20]，不能提供肝動脈、門脈灌注量及肝總灌注量等指標，有其局限性[21]，今后有待于進一步深入研究。

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ValueofMR-perfusionweightedimaginginthepathologygradingofhepaticfibrosisandcirrhosisofrat

WANG Guo-guang，MENG Ling-ping，HU Ming-xiu，et al.

Department of Radiology of Shanghai Sixth People′s Hospital Jinshan Branch，Shanghai 201599，China

Objective：To analyze the characteristics of MR-perfusion weighted imaging (MR-PWI) of hepatic fibrosis and cirrhosis of rat,and to assess the value of PWI in the pathology grading of liver fibrosis and cirrhosis.Methods100 clean SD rats，weighting ranged from 150～180g,male,were randomly divided into two groups:experimental group (n=84) and control group (n=16).Thioacetamide (TAA) was injected into the peritoneal cavity of the experimental group,and the same dose of normal saline was injected into the control group in the same way.Routine MR scanning and MR-PWI were applied afterwards.According to pathology results,liver damage was divided into 5 grades:fibrosis stage 0 (control group),Ⅰ(S1),Ⅱ(S2)，Ⅲ(S3) and existence of cirrhosis nodule (S4).The correlation of perfusion parameters and pathology grading was analyzed.ResultsPWI images were successfully obtained from 69 rats (69%;control group,n=12;experimental group n=57).There were significant differences among all groups of perfusion parameters of portal vein (Plt;0.05),as well as among all groups of perfusion parameters of liver parenchyma (Plt;0.001).TTP and WOR of portal vein were correlated with pathology grading of hepatic fibrosis and cirrhosis (r=0.420、-0.464,Plt;0.001).TTP and WOR of liver parenchyma were also correlated with pathological grading of hepatic fibrosis and cirrhosis (r=0.424、-0.488,Plt;0.001).ConclusionCorrelation was existed between MR-PWI parameters and pathology grading of hepatic fibrosis and cirrhosis of rats.MR-PWI provides clinical value for the grading of hepatic fibrosis.

Perfusion weighted imaging； Hepatic fibrosis； Hepatic cirrhosis； Animal model

201599 上海，上海市第六人民醫院金山分院放射科(王國光、孟令平、胡明秀、官兵)，病理科(洪玉萍)；200232 上海，復旦大學動物科學實驗部(喬偉偉)

王國光(1986-)，男，山東省青州人，主治醫師，主要從事功能磁共振成像對慢性肝病的診斷工作。

上海市科委醫學引導類項目(12119b1400)

孟令平，E-mail：menglingping2004@163.com

R445.2； R575.2

A

1000-0313(2017)11-1117-05

10.13609/j.cnki.1000-0313.2017.11.004

2016-11-09)