恐傷孕鼠所產80日齡仔鼠認知發育與海馬區多巴胺、二羥苯乙酸的相關性

李新民，楊麗萍，萬海嬌，朱江慧，侯俊林，詹向紅

(河南中醫藥大學中西醫結合基礎學科，鄭州 450046)

恐傷孕鼠所產80日齡仔鼠認知發育與海馬區多巴胺、二羥苯乙酸的相關性

李新民，楊麗萍*，萬海嬌，朱江慧，侯俊林，詹向紅

(河南中醫藥大學中西醫結合基礎學科，鄭州 450046)

目的考察恐傷孕鼠所產80日齡仔鼠認知發育與海馬區多巴胺(dopamine，DA)、二羥苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)含量的影響，并探討二者的相關性。方法應用旁觀電擊法建立恐傷腎孕鼠模型，通過對80日齡仔鼠進行Morris水迷宮實驗，觀察其認知發育；通過腦立體定位儀在右側海馬區采集腦透析液，應用高效液相色譜-電子俘獲檢測(HPLC-ECD)法測定仔鼠腦透析液中DA、DOPAC含量。結果與對照組比較，80日齡模型組仔鼠平均逃避潛伏期時間增加、游泳速度減慢、20%邊緣區域停留時間增長、跨臺次數減少，差異有顯著性(P< 0.05)；80日齡模型組仔鼠海馬組織細胞外液中DA、DOPAC的水平在各個灌流時間點均降低，差異有顯著性(P< 0.05)；80日齡仔鼠海馬區單胺類神經遞質DA與其平均逃避潛伏期、跨臺次數存在正相關，與20%邊緣區域停留時間存在負相關關系，相關性顯著(P< 0.05)；DOPAC與其平均逃避潛伏期、跨臺次數存在正相關，相關性顯著(P< 0.05)。結論恐傷孕鼠可影響其80日齡仔鼠空間學習記憶能力，減少海馬區DA、DOPAC含量，其認知發育水平與海馬區DA、DOPAC的含量降低密切相關。

恐傷孕鼠；認知發育；海馬區；多巴胺；二羥苯乙酸；相關性研究

地震、戰爭等自然災害和人為災害的發生，使恐懼情緒長期持續存在[1]。中醫情志學說認為“腎藏志，在志為恐”，而腎所藏之“志”的主要含義亦包括記憶，說明“恐”和記憶有內在的聯系[2]。長期的恐懼刺激勢必會對記憶產生不良影響，這一影響同其他慢性應激一樣會傳遞給子代，影響子代的學習記憶能力[3,4]。本課題通過旁觀電擊法建立恐懼模型，觀察孕期恐懼刺激對子代空間探索和學習記憶的影響，并研究其與海馬區多巴胺(dopamine，DA)及其代謝產物二羥苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)的相關性，以揭示子代認知能力改變的物質基礎。

1 材料和方法

1.1實驗動物

80日齡SPF級Wistar大鼠59只，其中，雌鼠34只，體重220～250 g；雄鼠25只，體重250～290 g。采用Morris水迷宮實驗評價其認知水平，選取基線水平一致的雌鼠按照隨機數字表法將實驗大鼠分為模型組和對照組，每組15只。選取基線水平一致且體格較強壯的15只雄鼠作為交配鼠，剩余的均作電擊鼠用。以上SPF級Wistar大鼠均由山東魯抗公司提供[SCXK (魯) 2014-0001]。雌鼠分組：按照隨機數字表法將實驗大鼠分為模型組和對照組，每組15只動物，多余的雌鼠備用，運用旁觀電擊法建立孕期恐傷腎大鼠動物模型[2]。微透析檢測探針放置在河南中醫藥大學實驗動物中心動物實驗設施內進行[SYXK(豫)2014-2312]。實驗獲得河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會的批準(20130016)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2實驗方法

1.2.1 恐傷腎孕鼠模型的建立

自制交流箱是參照Ogawa和Kuwabara[5]的Communication Box System改進而成，由45 cm × 45 cm × 30 cm有機玻璃組成，室內采用有機玻璃板分為9個15 cm × 15 cm × 30 cm小室，小室之間有機玻璃板上有若干直徑為1 cm小孔，既可供旁觀鼠逃避電擊攀爬，又可使旁觀鼠通過視覺、聽覺、嗅覺獲得臨近大鼠的恐懼信息。底部由直徑3 mm、間隔11 mm的不銹鋼絲組成，可以連接調壓器給予大鼠足底電擊。放置電擊鼠的中央小室及四角小室15 cm高處加隔板進行束縛，使其不能逃避足底電擊，而放置旁觀鼠的其余四個小室不加隔板。

模型制備的方法：自造模第1天起于9:00 a.m.將電擊鼠和旁觀鼠放入自制交流箱相應的小室內，電擊10次/d，3 min/次。具體如下：秒表定時165 s，定時結束后鳴響15 s，鳴響時段給予瞬時25～35 V電刺激6～8次，重復10次/d，旁觀鼠可以通過攀爬逃避電擊，電擊鼠卻因受到上部隔板的束縛遭受電擊表現為尖叫、跳躍、二便失禁，從而使旁觀鼠通過聽覺、視覺、嗅覺產生恐懼的心理反應。

1.2.2 雌鼠孕檢方法

各組雌鼠從第15天起于9:00 p.m.按雌雄2∶1合籠，次日7:00 a.m.檢查受孕情況。如發現雌鼠陰道口內有乳白色的陰栓，即可判定為受孕，記為孕第1天。如未發現陰栓可采用陰道涂片法進行進一步檢測。步驟如下：(1)陰道涂片：取待測雌鼠，一手將雌鼠固定并露出陰道口，另一手用沾有生理鹽水的棉簽輕輕地伸入雌鼠陰道1～2 cm，并緩慢轉動大半圈，抽出棉簽，迅速將棉簽上黏附物均勻平涂在載玻片上；(2)鏡檢：顯微鏡下觀察涂片，如發現長鉤狀的精子，即可判定為受孕，記為孕第1天。而未受孕的雌鼠繼續連續合籠12 d，如仍未受孕者則為不孕鼠。

仔鼠延續母鼠分組，按隨機數字表法從出生的仔鼠中每窩抽取5只繼續飼養，至80 d時再按隨機數字表法分別抽取15只進行Morris水迷宮實驗，并用微透析技術采集腦透析液檢測DA、DOPAC。

1.2.3 80日齡仔鼠學習記憶能力的測定(Morris水迷宮實驗)

選擇直徑為2 m的水池。空間定位航行實驗過程中應確保平臺位置保持不變，水溫控制在25～27℃，水位高于平臺約1 cm，水中加入高錳酸鉀攪拌均勻，以確保仔鼠在水池中游泳時看不到平臺，空間定位航行實驗連續進行3 d，第4天進行空間探索實驗。

空間定位航行實驗，歷時3 d，每天測試4次，每2次實驗間隔為40 min，每次實驗時隨機選取仔鼠的入水點，將其面向池壁放入水中，檢測2 min，仔鼠在平臺上停留超過5 s即為尋臺成功，若超過2 min依舊未找到平臺則需將動物引至平臺處，并使其在平臺上停留30 s，將仔鼠從入水到尋臺成功的時間記為逃避潛伏期，尋臺未成功的記潛伏期為120 s。第4天開始進行空間搜索實驗，撤去平臺，按照隨機數字表法選擇仔鼠4個象限的入水點，記錄仔鼠在2 min內的跨越平臺次數、游泳速度、20%邊緣區域停留時間。

1.2.4 80日齡仔鼠海馬區DA、DOPAC檢測

(1)腦透析液采樣：麻醉仔鼠，頭部剃除毛發后，將其固定在腦立體定位儀上，定位仔鼠右側海馬區，選取的坐標分別為：A：-2.8 mm，L：+3 mm，V：3.4 mm；A：-5.20 mm，L：+5 mm，V：6.5 mm，植入套管、探針，微量注射泵設定流速為1.5 μL/min，采集的透析液收集到自動采樣器的一次性EP管內，自動采樣器溫度設置為4℃，每20 min收集一管，收集完畢直接用高效液相色譜-電子俘獲檢測(HPLC-ECD)法進行檢測，未能及時檢測的放入-80℃冰箱內保存。

(2)標準品的配制：精密稱取DA、DOPAC各0.5 mg，置于10 mL定量瓶中，用林格氏液定容至10 mL制成母液，將母液分別稀釋并混合，最后制成濃度為100 ng/mL，50 ng/mL，25 ng/mL，12.5 ng/mL，6.25 ng/mL的梯度混合對照品溶液，置于-80℃冰箱保存。

(3)HPLC-ECD法測定仔鼠腦透析液中DA、DOPAC含量：色譜條件：流動相A為磷酸二氫鈉100 mmol/L，檸檬酸鈉50 mmol/L，EDTA 50 μmol/L，辛烷磺酸鈉1.7 mmol/L，氯化鉀2 mmol/L；流動相B為乙腈。A∶B=90∶10。設定流動相流速為0.125 mL/min，柱溫30℃，電化學檢測器應用玻碳工作電極，工作電壓為520 mV，增益為10 nA，進樣量為20 μL。

1.3統計學方法

服從正態分布且滿足方差齊性檢驗的數據，采用獨立樣本t檢驗。對于不滿足t檢驗條件的采用非參數秩和檢驗。采用Pearson積差分析法進行相關性分析，檢驗水準均取P=0.05，P< 0.05表明具有統計學意義。

2 結果

2.1Morris水迷宮實驗結果

80日齡模型組仔鼠較對照組同日仔鼠平均逃避潛伏期時間久、游泳速度慢、跨臺次數少、20%邊緣區域停留時間長，差異有顯著性(P< 0.05)。見表1、2。

Tab.1Mean escape latency of the 80-day-old neonatal rats in the spatial navigation test

組別Groups第1天1stday第2天2ndday第3天3rdday對照組Controlgroup51.23±13.1837.00±10.2724.75±6.96模型組Modelgroup74.03±9.60*54.87±10.00*41.15±9.46*

注：采用獨立樣本t檢驗，與對照組比較，*P< 0.05。

Note. Independent samplettest was used, and compared with the control group,*P< 0.05.

Tab.2Comparison of the indicators of 80-day-old neonatal rats in the space exploration test

組別Groups游泳速度/m/sSwimmingspeed20%邊緣區域停留時間/s20%timespentintheperipheralzone跨越平臺次數Frequencyofcrossingtheplatform對照組Controlgroup27.48±6.0530.49±8.044.27±1.33模型組Modelgroup15.45±2.47*40.90±5.78*2.06±1.03*

注：采用獨立樣本t檢驗，與對照組比較，*P< 0.05。

Note. Independent samplettest was used, and compared with the control group,*P< 0.05.

Tab.3Dopamine levels in the hippocampus of 80-day-old neonatal rats

組別Groups灌流時間/minTimepointsofperfusion80100120140160180對照組Controlgroup19.89±1.2819.84±1.2019.03±2.1019.85±1.0219.87±1.1718.96±1.52模型組Modelgroup3.44±0.68*3.59±0.91*3.62±0.79*3.70±0.76*3.71±0.82*3.80±0.85*

注：采用獨立樣本t檢驗，與對照組比較，*P< 0.05。

Note. Independent samplettest was used, and compared with the control group,*P< 0.05.

Tab.4DOPAC levels in the hippocampus of 80-day-old neonatal rats

組別Groups灌流時間/minTimepointsofperfusion80100120140160180對照組Controlgroup9.96±3.8510.47±4.2810.88±1.7010.15±4.809.97±4.038.80±4.35模型組Modelgroup5.09±3.35*4.99±3.25*5.08±3.23*4.86±3.27*4.96±3.09*4.70±3.22*

注：采用獨立樣本t檢驗，與對照組比較，*P< 0.05。

Note. Independent samplettest was used, and compared with the control group,*P< 0.05.

表5 仔鼠情志和認知發育與海馬區單胺類神經遞質相關性分析(r值)

注：*P< 0.05。

Note.*P< 0.05.

2.280日齡仔鼠海馬組織細胞外液中DA的水平

80日齡模型組仔鼠海馬組織細胞外液中DA的水平各個灌流時間點均較同日齡對照組仔鼠低，差異有顯著性(P< 0.05)。見表3。

2.380日齡仔鼠海馬組織細胞外液中DOPAC的水平

80日齡模型組仔鼠海馬組織細胞外液中DOPAC的水平各個灌流時間點均較對照組同日齡仔鼠低，差異有顯著性(P< 0.05)。見表4。

2.480日齡仔鼠認知發育與海馬區單胺類神經遞質相關性分析

80日齡仔鼠海馬區單胺類神經遞質DA與其平均逃避潛伏期、跨臺次數存在正相關，與20%邊緣區域停留時間存在負相關關系，相關性顯著(P< 0.05)；DOPAC與其平均逃避潛伏期、跨臺次數存在正相關，相關性顯著(P< 0.05)。見表5。

3 討論

海馬區是與學習記憶功能，尤其是空間學習和記憶能力關系最為密切的部位。行為學實驗表明多巴胺或多巴胺激動劑能增強記憶[6]，并且情景記憶在變成持久記憶的過程中，多巴胺是必需的神經遞質，而在衰老時的突出表現是多巴胺神經元缺失和情節記憶下降[7]。背側海馬區的多巴胺，無論從空間學習記憶、突觸可塑性到精神疾病潛在的缺陷，都發揮重要的作用；背側海馬缺乏腹側被蓋區多巴胺能軸突，而多巴胺受體網絡密集，背側海馬多巴胺能軸突以及釋放的多巴胺主要來自于藍斑神經元[8]。在空間學習記憶能力的形成過程中，多巴胺受體D1R和D5R起到獨一無二的作用[9]。故本研究在考察恐傷孕鼠對子代空間學習記憶能力的影響時，選擇應用微透析技術檢測海馬區DA及其代謝產物DOPAC的水平。

Morris水迷宮作為行為和認知神經科學最常用工具，能反映實驗動物空間學習和記憶能力，是進行學習記憶功能研究的可靠方法[10, 11]。研究結果表明：恐傷孕鼠所產80日齡仔鼠平均潛伏期延長，說明其空間學習和記憶能力降低；空間探索實驗中，恐傷孕鼠所產80日齡仔鼠游泳速度變慢、20%邊緣區域百分比變大，跨越平臺次數減少，表明恐傷孕鼠對仔鼠心理應激有遠期影響效應。海馬DA和DOPAC水平與其平均逃避潛伏期、跨臺次數存在正相關，且DA與20%邊緣區域停留時間存在負相關關系，說明恐傷孕鼠對仔鼠學習記憶能力的遠期影響，與DA和DOPAC水平的降低密切相關。

臨床研究表明，產前DA水平與抑郁分數呈負相關，與新生兒DA和行為調節呈正相關[12]；動物實驗結果則顯示產前應激引起多巴胺釋放減少[13]；而學習記憶能力的缺陷與海馬區解剖結構異常密切相關[14, 15]，這些研究均能印證本研究結果的可靠性，也為進一步深入研究指明方向。同時，膽堿能遞質也是公認的調控學習記憶的神經遞質，課題未來也會對其進行探索研究。

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Correlationbetweencognitivedevelopmentandlevelsofdopamineand3,4-dihydroxyphenylaceticacidinthehippocampusin80-day-oldneonatalratsbornoffear-impairedpregnantrats

LI Xin-min， YANG Li-ping*， WAN Hai-jiao， ZHU Jiang-hui， HOU Jun-lin， ZHAN Xiang-hong

(Department of Integrated Chinese and Western Medicine, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China)

ObjectiveTo investigate the correlation between cognitive development and levels of dopamine (DA) and 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) in the hippocampus of 80-day-old neonatal rats born of fear-impaired pregnant rats.MethodsThe pregnant rat model of fear-impaired kidney was established by watching other rats shocked with electricity. The cognitive development of the neonatal rats was assessed by Morris water maze test at 80 days after birth. The brain microdialysis samples of the right hippocampus were collected using a stereotaxic instrument, and the levels of DA and DOPAC were determined by HPLC-ECD.ResultsCompared with the control group, the mean escape latency of the 80-day-old neonatal rats in the model group was increased. Their swimming speed was slower. The 20% time spent in the peripheral zone became longer, and the frequency of platform crossing was decreased, showing significant differences (P< 0.05). The levels of DA and DOPAC in the extracellular fluid of the hippocampus of the 80-day-old neonatal rats in the model group were decreased at each time points of perfusion, showing a significant difference (P< 0.05). The level of DA, a kind of monoamine neurotransmitter in the hippocampus, was positively correlated with the mean escape latency, the frequency of passing the platform of the 80-day-old rats, while was negatively correlated with the 20% time spent in the peripheral zone, with a significant correlation (P< 0.05). In addition, there was a positive correlation between the DOPAC level and the mean escape latency, the frequency of passing the platform (P< 0.05).ConclusionsFear-impaired pregnant rats can affect the spatial learning and memory ability of their 80-day-old neonatal rats, with reduction in the levels of DA and DOPAC in the hippocampus, which is closely correlated with the cognitive development of the neonatal rats.

Fear-impaired pregnant rats; Cognitive development; Hippocampus; Dopamine, DA; 3,4-Dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC; Correlation study

國家自然科學基金醫學科學部面上項目(編號：81373790)。

李新民(1982 -)，男，博士，講師，研究方向：中西醫結合基礎。E-mail: xinmin081682@126.com

楊麗萍(1966 -)，女，博士，教授，研究方向：孕期心理應激與子代情志和認知發育關系。E-mail: bioylp@126.com

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0010-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.003

2017-01-10