豚鼠個體及品系間多態性微衛星位點篩選

衛 振，洪勝輝，劉迪文

(浙江大學實驗動物中心，杭州 310058)

豚鼠個體及品系間多態性微衛星位點篩選

衛 振，洪勝輝，劉迪文*

(浙江大學實驗動物中心，杭州 310058)

目的篩選豚鼠多態性微衛星標記，為鑒定豚鼠遺傳結構及基因定位提供基礎信息。方法從國外網站篩查得豚鼠基因組DNA資料，選擇AC、GT為核心的微衛星序列，根據其旁側序列用軟件設計400對引物。經過二輪PCR及電泳等實驗，以電泳條帶作為遺傳標記，通過豚鼠微衛星結構的評價篩選出多態性引物。結果第一步用5個品系豚鼠的10份DNA樣本進行PCR，從400對引物中篩選出約110對具有多態性的豚鼠引物，其產物電泳條帶數為1～3條。第二步用5個品系豚鼠的60份DNA樣本進行PCR，從上述110對引物中篩選出51對電泳條帶分辨率高的多態性引物，其中10余對引物在品系間呈標記一致或多數一致的差異。結論篩選出的51對引物在個體及品系間呈多態性，未見其他報道，可用于常規檢測研究，部分可能用于豚鼠性狀基因定位。

豚鼠；微衛星標記；多態性；遺傳結構

微衛星是基因組內含子的一種特殊DNA結構，由2～6個核苷酸序列片段首尾重復連接而成，動物品系或個體間因該片段重復次數不同，常致使微衛星總序列長度引起差異，表現出同一位點呈現多態性，因此微衛星成為研究實驗動物遺傳結構有用的工具。Burgos-Paz等[1]利用6對引物研究了哥倫比亞豚鼠的遺傳多樣性及群體結構。動物品系間呈一致性差異的微衛星標記是研究基因遺傳規律、定位新基因，進而揭示動物優勢性狀分子機理的分子標記，例如卲義祥等[2]利用39對小鼠品系間一致差異的微衛星標記，將導致角膜基質變性小鼠的突變基因定位至13號染色體。

豚鼠是藥理學、免疫學、病毒學、眼耳科疾病等研究領域應用的實驗動物，目前我國多數地區使用的是上世紀30年代從國外引進的英國種花色豚鼠，各地遺傳差異較大，實驗效果較差。近10年又引進DHP品系白色豚鼠，但應用數量少，缺乏有關生物學及特點資料。經過多年努力，本中心利用上述兩種豚鼠于2000年培育出Zmu-1: DHP遠交系白色豚鼠[3]，同時還分離出Zmu-2: DHP遠交系黑色豚鼠。研究發現，Zmu-1: DHP品系豚鼠具有多項優越性狀[4-6]。

眾所周知，遠交系基因呈高度雜合，性狀基因定位難度較大，而近交系則基因純合，個體遺傳一致，成為定位新基因理想的材料。于是，本中心于2002至2015年將Zmu-1: DHP遠交系豚鼠培育成Zmu-1: DHP近交系白色豚鼠(22代)[7]。2009至2015年又將Zmu-2: DHP遠交系培育成Zmu-2: DHP部分近交系黑色豚鼠(9代)。

截止目前本中心已有5個品系的豚鼠，要鑒定這些種系的遺傳結構，研究其遺傳特性的分子機理，定位優越性狀的基因，必須設計一種實驗思路，而借助微衛星作為分子標記輔助進行上述研究不失為一種方便可靠的方法。因微衛星位點廣泛分布于動物基因組，人們對其數量掌握得越多，就越能發揮其作用。本文擬從豚鼠基因組中克隆微衛星位點，并篩選出多態性的位點及品系間呈一致差異的位點，為豚鼠育種、分子遺傳結構鑒定及優越性狀基因定位等奠定基礎。

1 材料和方法

1.1實驗動物

英國種遠交系花色豚鼠15只；Zmu-1: DHP遠交系白色豚鼠20只；Zmu-2: DHP遠交系黑色豚鼠15只；Zmu-1: DHP近交系白色豚鼠6只(其中1亞系1只，2亞系5只)；Zmu-2: DHP近交系黑色豚鼠4只。所有豚鼠性別不限，成年，體重300～450 g,普通級 [SCXK (浙) 2012-0052]，[SYXK(浙)2012-0178]。

1.2主要儀器

PCR儀(ABI公司)；電泳儀(Bio-Rad公司)；凝膠圖像儀(Bio-Rad公司)；離心機(Eppendorf公司)；等。

1.3實驗方法

1.3.1 豚鼠基因組DNA提取

豚鼠行心臟采血每只1 mL，肝素抗凝，按照說明書介紹用Takara試劑盒提取豚鼠基因組DNA，最后溶解在TE緩沖液中。

1.3.2 微衛星引物設計

從加州大學圣克魯茲學院Genome Browser Home(http://genome.ucsc.edu/)網站的數據庫內隨機查找核心為AC、GT重復序列的豚鼠微衛星DNA序列，用Promer 5.0軟件設計引物序列，委托Invitrogen公司合成引物。

1.3.3 小樣本多態性微衛星位點引物篩選

隨機從上述5個豚鼠品系中，共選取10份樣本，通過PCR進行初次擴增，用凝膠電泳篩選出多態性較高、條帶少及清晰度高的位點引物。豚鼠微衛星位點PCR擴增，產物電泳及電泳條帶鑒定等方法見參考文獻[8]。

1.3.4 多樣本個體及品系間多態性微衛星位點引物篩選

從1.3.3篩選出的多態性微衛星位點中，挑選差異程度高、條帶距離較遠的引物，對上述5個豚鼠品系的60份樣本進行PCR，篩選出多態性高，品系內基本一致、品系間呈差異的引物。

2 結果

2.1豚鼠多態性位點初步篩選

通過網站搜索，共設計400個豚鼠微衛星位點的引物，用小樣本篩選出約110對多態性引物，部分引物PCR產物電泳圖譜見圖1。

從圖中可見，被選豚鼠微衛星位點擴增條帶清晰，多態性差異較大，條帶間區分顯著，條帶數量1～3條，其DNA序列長度在100～250 bp之間。

2.2多樣本豚鼠多態性位點的篩選

從110對引物擴增的分子標記中，挑選出51對擴增質量較好的多態性微衛星引物(見表1)進行PCR，其中15對引物(標注*)擴增2個近交系及3個遠交系，36對引物擴增3個遠交系豚鼠DNA。部分引物擴增產物電泳圖譜見圖2。

從圖中可見，同一近交系豚鼠內個體之間條帶一致性較高，不同近交系之間的條帶存在較大差異，而遠交系個體及品系間條帶均呈現高度多態性，符合遺傳規律，說明本文中多態性位點的篩選方法及選擇出的位點是可靠的，這些引物擴增的位點作為分子標記，能用于豚鼠遺傳基因純度的檢測。

2.3品系間一致性差異位點的篩選

從51個位點中，挑選出豚鼠品系內基因標記基本一致，品系之間呈差異的位點，這些位點的基因型列于表2。

注：A：引物L1 PCR產物；B：引物L107 PCR產物；C：引物L70 PCR產物；D：引物D122 PCR產物。M：Marker；泳道1～2：英國種；泳道3～4：Zmu-2: DHP遠交系；泳道5～6：Zmu-1: DHP遠交系；泳道7～8：Zmu-2: DHP近交系；泳道9～10：Zmu-1: DHP近交系。圖1 10個豚鼠DNA樣本PCR產物電泳圖Note. A: PCR products of primer L1; B: PCR products of primer L107; C: PCR products of primer L70; D: PCR products of primer D122. M: Marker; Lane 1-2: English species; Lane 3-4: Zmu-2: DHP outbred strain; Lane 5-6: Zmu-1: DHP outbred strain; Lane 7-8: Zmu-2: DHP inbred strain; Lane 9-10: Zmu-1: DHP inbred strain.Fig.1 PCR products of 10 DNA samples of guinea pigs

序號No.引物名稱Primernames引物序列Primersequences退火溫度Annealingtemperature序號No.引物名稱Primernames引物序列Primersequences退火溫度Annealingtemperature1L32aagggatgtgtgctactgtaggatctcgaaggatgttggagct6027L166ttccacttgggaatcaagcatacttgccaagcagactccct582L45*gctgaaacttagctctcagactgagagagatgttggtttgcttacc5828L360agctacgctgagtgatgttcaaccacacaggagcatgg583L53*tggcaaagttgcttcaatggaccttgcatagaatactctgggca6029L388tgagaaggcagctgaacttatccatgctactaccaagagc574L56*gtctgtggtaatcaggacaccgaatgggtcctggagcatgtctc5930D18ctgccaaggttccacagtgggtgtctactgcaacggaa625L57*gcactttctaacccgaatgagggctgtcatggagaaaggtcttgg5931D31tcgggatactgcaaactcattaaaggggcttctcaagtc626L70*tgtctaaacgtaggaaactgcacgatatggctcactgccaaggtc6032D41aaggggagaagcctgagtatggagttcagtgtctccac587L74*tcaaggtcagcctgaaccatacacagatgttctgagtccga5833D50caatgctgcagtttgggtttgtgtggatcttggccctc628L85*cagctttgaacaagggaggtagtgtgaagtttcttgcgatgg5834D55atgatggcgcatgcctgtagccattctggaacatggtgc629L148*tctttgcttccagcaggtgccctgatgaagcacttagg6035D105gacagacatgcctagattcagcacctccagtgacttggga5810D149*ctagtgccccttgtatctgggtcaactgaacctcagcac6036D107tgggcctttgtccttcatcccaaacagtccccacattgtg6211D77*ctgctcttgcctgaagtgctttgtgaccgtggcacaagg6237D113agctaaccagggcactttgctgatcagaccctaaggccca62

(續表)

注：*表示用于擴增2個近交系及3個遠交系的15對引物。

Note.*indicates the 15 pairs of primers used for PCR of the two inbred strains and three outbred strains.

注：A：引物L45 PCR產物；B：引物L70 PCR產物；C：引物L74 PCR產物；D：引物D86 PCR產物。M：Marker；泳道1～20：Zmu-1: DHP遠交系；泳道21：Zmu-1: DHP近交1系；泳道22～26：Zmu-1: DHP近交2系；泳道27～30：Zmu-2: DHP近交系；泳道31～45：英國種；泳道46～60：Zmu-2: DHP遠交系。圖2 60個豚鼠DNA樣本PCR產物電泳圖Note. A: PCR products of primer L45; B: PCR products of primer L70; C: PCR products of primer L74; D: PCR products of primer D86. M: Marker; Lane 1-20: Zmu-1: DHP outbred strain; Lane 21: Zmu-1: DHP inbred strain, substrain 1; Lane 22-26: Zmu-1: DHP inbred strain, substrain 2; Lane 27-30: Zmu-2: DHP inbred strain; Lane 31-45: English species; Lane 46-60: Zmu-2: DHP outbred strain.Fig.2 PCR products of 60 DNA samples of guinea pigs

序號No.引物名稱Primernames基因型GenotypesZmu-1:DHP遠交系Zmu-1:DHPoutbredstrainZmu-1:DHP近交系1系Zmu-1:DHPinbredstrain,substrain1Zmu-1:DHP近交系2系Zmu-1:DHPinbredstrain,substrain2Zmu-2:DHP遠交系Zmu-2:DHPoutbredstrainZmu-2:DHP近交系Zmu-2:DHPinbredstrain英國種Englishspecies1L451/20a.16/20b.3/20ab1/1a3/5a.2/5ab13/15b.2/15ab4/4b2/15a.5/15b.8/15ab2L561/20a.16/20b.3/20ab1/1a5/5a13/15b.2/15ab4/4b5/15a.3/15b.7/15ab3L7011/20a.9/20b1/1a5/5a15/15b4/4b3/15a.12/15b4L7410/20a.1/20b.9/20ab1/1b5/5ab10/15b.5/15ab4/4b9/15b.6/15ab5L8517/20a.3/20b1/1b5/5a5/15a.10/15b3/4a.1/4b10/15a.5/15b6D11714/20a.6/20b1/1b5/5a15/15a3/4a.1/4b13/15a.2/15b7L1481/20a.10/20b.9/20ab1/1a5/5b5/15a.3/15b.7/15ab2/4b.2/4ab7/15a.5/15b.3/15ab8D10713/20b.7/20ab15/15ab2/15a.12/15ab9D11318/20b.2/20ab15/15a15/15a10D1225/20a.15/20b11/15a.4/15b12/15a.3/15b11D14017/20a.3/20b4/15a.11/15b6/15a.9/15b12L261/20a.12/20b.7/20ab1/15a.6/15b.9/15c10/15b.5/15c

從表中可見，遠交系品系間差異較為一致的位點有L70、L74、D113、D122、D140、D107、L26；近交系品系間差異一致的位點有L45、L56、L70等；近交系支系間的差異位點有L85、D117、L148等。近交系同一基因座上兩個等位基因標記與豚鼠毛色存在顯著關系，表2中的分子標記或許對品系鑒定及新特征基因定位有一定意義。

3 討論

微衛星DNA是動植物遺傳鑒定及基因定位等很有價值的分子標記，目前已開發出大約兩萬個大小鼠微衛星標記，對利用大小鼠研究做出非常大的貢獻，但豚鼠作為實驗動物其開發的微衛星位點數量少至甚少，然而豚鼠卻有許多大小鼠不具備的遺傳特性可以被人類利用[8]。其次微衛星標記眾多，用微衛星檢定豚鼠品系遺傳質量快速可靠，微衛星標記還可以輔助育種工作，因此開發大量豚鼠微衛星標記具現實意義。筆者曾從網站上隨機搜索并設計178對豚鼠微衛星引物，篩選出25個多態性位點及28個潛在多態性位點，占29.8%[8]。隨著該網站豚鼠基因組數據不斷擴充，本文又從該網站搜索到400個位點，剔除不能設計引物、擴增效果不佳及非多態性的位點，篩選到約110個多態性位點，占27.55%。經擴大樣本量進一步篩選出51個擴增質量較高的多態性位點，從中隨機挑選15對引物檢測了近交系及遠交系豚鼠的遺傳結構，結果顯示遠交系位點條帶多態性高，個別雜無規律；近交系條帶數少，位置集中，亮度高，且品系間呈一致性差異，檢測結果比較理想[7]。由此說明本文開發的位點是有效可靠的，適合于豚鼠日常遺傳質量檢測。同時證明多態性微衛星位點開發難度較大，特別是篩選遠交系間呈一致差異的位點難度則更大。

動物微衛星位點引物的獲取至少有3種方法，一是直接從網上下載同種動物的基因組微衛星資料，設計引物；二是從該動物基因組中克隆微衛星序列，設計引物；三是用鄰近動物已有的引物。第一種方法簡單易行，篩選效率高，但需要已公布的物種基因組；第二種方法費用較大，有假陽性克隆出現；第三種方法常出現偶然性，篩選效率較低。因此在已有基因組資料的情況下，第一種是值得推薦的方法。本文從加州大學圣克魯茲學院網站的數據庫，搜索到豚鼠基因組隨機片段序列的資料，在這些序列中找出微衛星結構，然后用軟件設計豚鼠微衛星引物，結果用51對多態性微衛星引物，篩選到12個品系間基本呈一致差異的位點，筆者認為本辦法篩選效果比較好，很少出現引物PCR擴增不出條帶的情況。

多態性微衛星標記用于動物遺傳質量檢測及群體遺傳基因分析的原理眾所周知。微衛星基因座上兩個等位基因作為遺傳標記，如果在兩個品系間呈一致性差異，那么該基因座就可以定位性狀基因。其原理是通過不同品系動物雜交和回交，如能發現某微衛星位點上一個等位基因與某品系的一種性狀連鎖，而另一等位基因與另一品系的相對性狀連鎖，通過連鎖分析該微衛星與性狀的連鎖性，計算出該連鎖率LOD值，那么只要LOD大于一定值，并確定該微衛星位點位于第幾條染色體，就能將該性狀基因定位到相應染色體上。本文發現，L70、D113、D122、D140等微衛星位點的2個等位基因分別與2個遠交系的不同毛色相對應，L74、L56、L70等位點的等位基因與2個近交系的不同毛色相對應，通過兩個品系的測交試驗及連鎖分析，有可能找到與毛色連鎖的微衛星位點，如毛色性狀又與某個性狀連鎖，則最后能將該性狀基因定位至特定染色體。因此，篩選品系間呈一致性差異的微衛星是前提因素，在基因定位中有重要的作用。

[1] Burgos-Paz W, Cerón-Muoz M, Solarte-Portilla C. Genetic diversity and population structure of the Guinea pig (Caviaporcellus, Rodentia Caviidae) in Colombia [J]. Genet Mol Biol, 2011, 34(4): 711-718.

[2] 邵義祥, 吳寶金, 薛整風, 等. 遺傳性角膜基質變性小鼠及其突變基因的定位 [J]. 南京師范大學(自然科學版), 2006, 29(2): 99-102.

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Screeningofmicrosatellitelociwithpolymorphismamongindividualsandstrainsofguineapigs

WEI Zhen， HONG Sheng-hui， LIU Di-wen*

(Laboratory Animal Center, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

ObjectiveTo screen the polymorphism microsatellite markers of guinea pigs, and provide basic information for identification of genetic structure and gene mapping in guinea pigs.MethodsThe genomic DNA of guinea pigs was found out on foreign websites, and microsatellite sequences characterized by AC/GT were selected. A total of 400 pairs of primers were designed using software according to their flanking sequences. After two rounds of PCR and electrophoresis, with the electrophoresis bands serving as genetic markers, the polymorphic primers were screened by the evaluation of microsatellite structure of guinea pigs.ResultsAt the first step, 10 DNA samples from 5 strains of guinea pigs were taken for PCR, and 110 pairs of polymorphic microsatellite markers with 1-3 electrophoretic bands were screened from the designed 400 pairs of primers. At the second step, 60 DNA samples from 5 strains of guinea pigs were assayed by PCR and 51 pairs of polymorphic primers with high resolution electrophoresis bands were screened from the above 110 pairs of primers. Among these screened 51 primers, more than 10 pairs of primers showed accordant or mostly accordant differences among strains.ConclusionsThe 51 pairs of primers are polymorphic among individuals and strains, and have not been found in other reports so far.They can be used for conventional genetic detection and related studies, and some of them can be used for gene mapping of the traits in guinea pigs.

Guinea pigs; Microsatellite markers; Polymorphism; Genetic structure

浙江省公益技術應用研究(實驗動物)計劃項目(編號：2017C37144)；衛生部科學研究基金(編號：98-2-323)。

衛振(1982 -)，男，研究方向：實驗動物模型資源開發。E-mail: mudi001@126.com

劉迪文(1958 -)，男，研究方向：實驗動物育種與遺傳學。E-mail: liudiwen2004@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0032-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.007

2017-03-17