一種易操作的小鼠肝細胞的分離及培養方法

范仕郡，劉 鑫，楊 東，祝元鋒，魯永玲，鄭 江

(第三軍醫大學第一附屬醫院中心實驗室，重慶 400038)

經驗交流

一種易操作的小鼠肝細胞的分離及培養方法

范仕郡，劉 鑫，楊 東，祝元鋒，魯永玲，鄭 江*

(第三軍醫大學第一附屬醫院中心實驗室，重慶 400038)

目的在傳統肝細胞提取方法的基礎上，優化一種易操作、快速實用獲取小鼠肝細胞的方法，為從事肝臟功能相關研究人員提供改良的實驗方法參考。方法以肝臟分離液逆向灌注小鼠肝臟后，剪碎，肝臟酶消化后密度梯度離心分離肝細胞，轉入培養基培養。采用臺盼藍染色計算細胞活力，流式細胞檢測技術計算純度，倒置顯微鏡觀察細胞形態。結果獲得較高純度和活力的肝細胞，具備肝細胞的典型形態特征。結論通過逆向灌注，降低了灌注的難度，同時獲得較高純度、較高活力的肝細胞，經多次實驗證明該方法確實是一種易操作、高效適用的肝細胞提取方法。

C57BL/6J小鼠；肝細胞；逆向灌注；活力；純度

肝臟是人體最大的實質器官和重要的排毒器官。在人體中擔負著去氧化、存儲肝糖、合成分泌性蛋白質等重要作用。同時也是消化系統中重要的消化腺。它可以制造膽汁來幫助食物的消化，也是尿素合成的主要臟器，更是新陳代謝的重要器官[1]。因此，肝臟對于人體的重要作用不言而喻。肝臟細胞主要由肝細胞(hepatocytes，HC)、枯否細胞(Kupffer cells，KC)、肝星形細胞(liver stellate cells，HSC)和肝血竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cells，LSEC)構成，肝細胞占肝臟細胞80%以上[2]。其作用主要表現在合成凝血因子和多種消化酶以及膽汁、調節內分泌、代謝儲能、清除毒素等方面。肝細胞形態為多角形，直徑約幾十微米級，具有六至八個面。不同的生理條件下肝細胞大小有差異，在饑餓時肝細胞體積變大。每個肝細胞表面可分為竇狀隙面、肝細胞面和膽小管面三種。肝細胞里面含有非常多復雜的細微結構：如肝細胞核、肝細胞質、線粒體、內質網、溶酶體、高爾基氏體、微粒體及飲液泡等組成[3]。然而，在實驗中細胞株并不能滿足所有的研究需求。本文主要是提供一種實用的肝細胞提取方式，為從事病毒性肝炎、肝硬化和肝癌方面。以及少數從事肝臟的遺傳性代謝疾病、免疫性肝病、藥物和化學中毒性肝病、肝血管性疾病等研究者提供一些參考。

1 材料和方法

1.1實驗動物

SPF級10周齡C57BL/6J雄性小鼠2只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司 [SCXK (京) 2014-0004]。實驗前禁食12 h，小鼠手術及取材過程均在第三軍醫大學第一附屬醫院動物實驗室內進行 [SYXK (渝) 2017-0011]，按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2主要試劑與儀器

VS-1300L-U型潔凈工作臺(中國蘇州安泰空氣技術有限公司)；1300系列A2生物安全柜(美國Thermo公司)；倒置BDS200-P型顯微鏡(中國重慶奧特光學儀器有限公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)；Harvard 2000型精密注射泵(美國Harvard公司)；CO2恒溫細胞培養箱(美國Thermo公司)；ST-40R臺式離心機(美國Thermo公司)；Nano Drop 2000分光光度計(美國Thermo公司)；CPA2250型電子天平(德國Sartorius公司)；蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)；ChemiDocTMXRS+超高靈敏度化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司)；TC20自動細胞計數儀(美國Bio-Rad公司)；微量移液器(美國Millipore公司)；Zeiss LSM 780激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)；MS分離柱及MACS分離器(德國Milternyi Biotec公司)；漩渦振蕩器(中國上海科學儀器廠)；電熱恒溫水浴箱(中國上海科學儀器廠)。

60 mL注射器，靜脈輸液針(規格0.7 mm)，注射器針頭，無菌大玻璃平皿，吸耳球，無菌10 mL玻璃吸管，無菌15 mL離心管，無菌1.5 mL離心管，無菌50 mL離心管，眼科手術剪，眼科鑷(平口及有齒)，酒精燈，止血鉗，小動脈夾，微量移液器(規格1000 μL)。

1.2.1 肝細胞分離液I

D-Hank’s平衡溶液(不含鈣、鎂離子)250 mL為基礎液，加入EDTA 46.5 mg和葡萄糖250 mg，振蕩溶解后，經0.22 μm超濾，轉入50 mL無菌離心管分裝。

1.2.2 肝細胞分離液II

Hank’s平衡溶液(含鈣、鎂離子)250 mL為基礎液，加入葡萄糖250 mg、HEPES 1191.5 mg和IV膠原酶40 mg，振蕩溶解后，經0.22 μm超濾，轉入50 mL無菌離心管分裝。

1.2.3 肝細胞分離液III

Hank’s平衡溶液(含鈣、鎂離子)250 mL為基礎液，加入輔助試劑葡萄糖250 mg、HEPES 1191.5 mg、IV膠原酶40 mg和DNase I 2.5 mg，振蕩溶解后，經0.22 μm超濾，轉入50 mL無菌離心管分裝。

1.2.4 肝細胞分離用洗滌緩沖液

取100 mL PBS溶液，加入1 g BSA，振蕩溶解后，經0.22 μm超濾，轉入50 mL無菌離心管分裝。

1.2.5 密度梯度離心液(10% OptiPrep)

無菌生理鹽水(V/V=4∶2)，即取4 mL OptiPrepTM加入2 mL無菌生理鹽水，配成6 mL WS工作液，充分混勻，4℃避光，備用；配置5 mL的10% OptiPrep，即精確吸取1.25 mL WS工作液加入3.75 mL無菌生理鹽水，至15 mL無菌離心管內混勻，4℃避光保存。

1.3實驗方法

1.3.1 小鼠肝臟的原位灌洗

用60 mL注射器吸取已預溫至37℃的原代肝細胞分離液I并連接好靜脈輸液針與注射器，并將注射器固定在注射泵插槽內，白熾手術燈距其約20 cm加熱，進行保溫。將預凍冰袋置于不銹鋼托盤上。小鼠經脫臼處死后，立即用注射器針頭固定四肢置于不銹鋼托盤的冰袋上，用75%乙醇消毒腹部皮膚，“U”形切口剪開小鼠腹部、胸，并沿胸廓外沿剪開，完全剪開隔肌，暴露胸、腹器官，并可視心臟下腔靜脈，用平口鑷將腹部臟器向右外側牽拉，暴露并識別肝門靜脈。第一步灌洗，用止血鉗結扎小鼠肝前靜脈及心臟下腔靜脈后，用靜脈輸液針穿刺肝后靜脈，進入約5 mm，并同時用小動脈夾固定穿刺入針頭前端約3 mm位置，剪開肝門靜脈，隨后開始灌注肝細胞分離液I，設定流速為6 mL/min，灌注體積為20 mL/只，灌流方向從肝后靜脈進入，從肝門靜脈流出，行逆行灌注；可見肝門靜脈缺口有大量血液流出(如圖1A)，并逐漸減少，肝臟完全變為土灰色。第二步灌洗，待第一步灌洗結束后，隨即改用已預溫至37℃的原代肝細胞分離液II進行灌洗，設定流速為3 mL/min，灌注體積為20 mL/只，可見肝門靜脈缺口已無血液流出，液體清亮，肝臟逐漸變為土黃色(如圖1B，體積明顯膨脹，用平口鑷輕觸肝臟表面可見不可復原小坑出現[4, 5]。

注：A：第一步灌洗開始；B：第二步灌洗結束。圖1 小鼠肝臟原位灌洗示意圖Note. A: Beginning of the first perfusion; B: Ending of the second perfusion.Fig.1 In situ liver perfusion of a mouse

1.3.2 小鼠肝臟的酶消化

用眼科手術剪無菌剝離全肝(去除膽囊部分)，經4℃，含1% FBS的無菌PBS溶液漂洗后，迅速轉至盛有已預熱至37℃的肝細胞分離液III的15 mL大玻璃平皿；將小鼠肝臟經眼科剪剪至大小1 mm3后轉入37℃水浴鍋消化15 min；立即向每個肝臟加入5 mL DMEM培養基(含10% FBS)混勻，中止酶消化。

1.3.3 單細胞懸液的制備

消化處理后的肝組織懸液經100 μm細胞濾器過濾后，再經4℃的肝細胞分離用洗滌緩沖液補充體積至30 mL，4℃，750 r/min，5 min離心；吸棄上清，再加入5 mL肝細胞分離用洗滌緩沖液，4℃，750 r/min，3 min離心，洗滌2次，目視上清無明顯渾濁出現。

1.3.4 肝細胞的密度梯度離心分離

沿管壁加入5 mL 10% OptiPrep，用微量移液器吹打至獲得的細胞沉渣均勻分布，轉移至無菌15 mL離心管內；再在上層加入5 mL肝細胞分離用洗滌緩沖液，不混勻，標記并立即進行4℃，750 r/min，10 min離心，吸棄上清后，再加入肝細胞分離用洗滌緩沖液2 mL，4℃，750 r/min，2 min離心洗滌，獲得肝細胞。

1.3.5 原代肝細胞的貼壁培養

向獲得的肝細胞沉淀中加入1 mL DMEM培養基(含10% FBS)后，混勻，用細胞計數板計算細胞濃度，按接種密度為2 × 105個/mL立即接種于預包被有大鼠鼠尾膠蛋白的六孔板或細胞培養皿中。每個培養皿所加培養基以視培養基厚度為1.6～1.8 mm為準，于37℃，5% CO2細胞培養箱中培養，2 h后細胞貼壁，吸棄上清，加入1 mL DMEM培養基(含10% FBS)小心洗滌未貼壁細胞，再加入DMEM培養基(含10% FBS)，37℃，5% CO2細胞培養箱中繼續培養(如圖2)。

圖2 肝細胞培養24 h后形態(× 40)Fig.2 Morphology of hepatocytes after culture for 24 h

1.3.6 TC20自動細胞計數儀計算

分離后獲得的肝細胞純度檢測采用流式細胞檢測技術，對FITC標記細胞角蛋白18(cytokeratin 18)抗體(FITC-At18)標記的肝細胞進行分析，即分離后的肝細胞懸液約100 μL，分別加入2支無菌15 mL離心管內，標記為陰性對照(negative control，NC)管和FITC-At18標記的肝細胞(FITC-At18-HC)管，再分別加入1 mL 4%多聚甲醛，4℃，避光固定15 min后，分別加入1 mL PBS溶液，混勻，4℃，750 r/min，3 min離心，如此洗滌3次；加入3% BSA，4℃，封閉30 min后，4℃，750 r/min，3 min離心，吸棄上清，再加入500 μL按FITC標記抗細胞角蛋白18抗體原液: 3% BSA(V/V)=1∶300稀釋后的抗體，4℃，避光過夜孵育；次日，每次以1 mL PBS溶液進行洗滌，4℃，750 r/min，3 min離心，洗滌3次，再加入200 μL PBS溶液，進行流式細胞儀檢測。

1.3.7 原代肝細胞的活力分析

分離肝細胞的活力分析(臺盼藍拒染實驗)：取0.2 mL 4%臺盼藍母液，加入1.8 mL PBS溶液中，稀釋為0.4%作為臺盼藍工作液。取分離后的原代肝細胞懸液約100 μL加入1支無菌1.5 mL離心管內，加入0.9 mL 0.4%臺盼藍工作液，3 min染色后，利用TC20自動細胞計數儀計數未被染色的細胞數，得活細胞數及活細胞率。

2 結果

2.1純度分析

通過TC20自動細胞計數儀計算，細胞濃度為5.95 × 105個/mL；從檢測結果來看，紅色為NC組，藍色為FITC-At18-HC組，測得FITC-At18-HC組陽性細胞百分比為91.3%，表明初次分離獲得原代肝細胞純度為91.3%(見圖3)。

圖3 分離肝細胞的純度測定Fig.3 Purity analysis of the isolated hepatocytes

2.2活力分析

通過臺盼藍拒染實驗，測得初次分離的原代肝細胞在未貼壁培養前的存活率為90.5%(見圖4)。

圖4 臺盼藍拒染實驗測定細胞活力(× 40)Fig.4 Cell viability determined by trypan blue exclusion test

3 討論

肝臟是生理和病理狀態下能量代謝、毒素的生物轉化以及血漿蛋白合成的中心器官，是機體最重要的器官之一[6]。肝細胞培養體系可以很好地模擬體內肝臟生理環境，作為研究肝特異代謝過程和肝臟功能的重要工具，被廣泛用于毒理學和藥理學的研究[7, 8]。因此，建立和改進實驗動物肝細胞的提取方法具有重要意義。

從實驗對象來看，目前常規的肝細胞提取操作大多在大鼠中開展。主要原因是大鼠體型相對較大，且實驗易操作，獲取的肝細胞產量較高。然而目前大多數基因敲除或轉基因模型均在小鼠中建立，因此優化小鼠肝細胞提取技術對開展生命科學相關研究更具意義。從操作流程來看，常規肝細胞提取主要采用膠原酶浸泡的方法消化組織。該方法雖然操作簡單(無需灌注)，但是浸泡消化的時間和強度不易掌握，得到的肝細胞質量不好(活力一般低于80%)[9]，不能滿足有些實驗的需求。因此本研究選擇了操作復雜但效果更好的酶灌注消化法。灌流在肝細胞提取中又是非常重要的環節，直接決定實驗所獲取細胞的質量。在實際操作中我們發現，小鼠門靜脈非常細小，不易穿刺。經過多次摸索，我們在兩步灌洗法的基礎上，優化出一種更易操作的方法，即采用下腔靜脈進、門靜脈出的方式。下腔靜脈相對門靜脈更粗，因此方便穿刺操作。該改良方法相對降低了實驗的操作難度，降低了對實驗材料的要求(常見的靜脈輸液針即可滿足需求)。同時經改法獲得的肝細胞純度和活力均在90%以上，能夠滿足大多數的實驗需求。在實驗中我們也發現，該方法的主要不足之處在于灌流液體可從門靜脈流出，因而增大了細胞污染的幾率，故要求實驗者在操作時應小心謹慎。課題組在傳統肝細胞提取方法的基礎上，改變了灌流方式，得到了良好的實驗結果，為從事相關研究者提供參考。同時，建立和完善肝細胞長期培養技術將為人工生物肝臟研究及其臨床應用提供技術參考，具有重要意義。

[1] Strnad P, Tacke F, Koch A, et al. Liver—guardian, modifier and target of sepsis [J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2017, 14(1): 55-66.

[2] 楊東, 劉鑫, 鄭新川, 等. 小鼠肝臟細胞分離和原代培養技術研究進展 [J]. 重慶醫學, 2015, 44(34): 4851-4854.

[3] Ueno T, Komatsu M. Autophagy in the liver: functions in health and disease [J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2017, 14(3): 170-184.

[4] 彭齊榮, 袁愛力, 賴卓勝, 等. 肝細胞的大量制備技術 [J]. 中華肝臟病雜志, 1999, 7(4): 246.

[5] 劉學忠, 李慧敏, 王富民, 等. 大鼠肝細胞分離和原代培養的簡易方法 [J].江蘇農業學報, 2009, 25(1): 222-224.

[6] Liu W, Hou Y, Chen H, et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies [J]. Proteomics, 2011, 11(17): 3556-3564.

[7] Vinken M, Maes M, Oliveira AG, et al. Primary hepatocytes and their cultures in liver apoptosis research [J]. Arch Toxicol. 2014, 88(2): 199-212.

[8] Shulman M, Nahmias Y. Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes [J]. Methods Mol Biol, 2013, 945: 287-302.

[9] 王琳, 徐建波, 田元, 等. 一種分離新生小鼠肝細胞的簡單方法 [J]. 中國優生與遺傳雜志, 2007, 15(1): 10-12.

Asimplifiedmethodforisolationandcultureofprimarymousehepatocytes

FAN Shi-jun， LIU Xin， YANG Dong， ZHU Yuan-feng， LU Yong-ling， ZHENG Jiang*

(Medical Research Center, First Affiliated Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

ObjectiveTo simplify and optimize the method for isolation and culture of primary mouse hepatocytes on the basis of conventional extraction method, and to provide a reference for related research.MethodsMouse liver was reversely perfused with the isolation solution (i.e., through the vena cava inferior in, and portal vein out), cut into small pieces and digested with enzymes. Then the hepatocytes were isolated by density gradient centrifugation and transferred into culture medium. The cell viability was detected by trypan blue staining. The purity of the hepatocytes was analyzed by flow cytometry and the cell morphology was observed with an inverted microscope.ResultsThe hepatocytes obtained by this improved method showed high viability and purity, with typical characteristics of cell morphology.ConclusionsThe liver perfusion is facilitated by reversed perfusion, and the isolated hepatocytes are with high viability and purity confirmed by many times of experiments. This optimized procedure is an easy and efficient method for isolation of primary mouse hepatocytes.

C57BL/6J mice; Hepatocytes; Reversed perfusion; Viability; Purity

國家自然科學基金項目(編號：81372089)。

范仕郡(1983 -)，男，助理研究員，研究方向：膿毒癥的發病機制與拮抗措施研究。E-mail: 574472439@qq.com

鄭江(1961 -)，男，研究員，研究方向：膿毒癥的發病機制與拮抗措施研究。E-mail: zhengj@tmmu.edu.cn

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0075-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.015

2017-03-20