不同產(chǎn)地壯藥夜香牛中木犀草素的含量測定

譚小明 周小雷 周雅琴 趙以民 余麗瑩

西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室/廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023

藥物研究

不同產(chǎn)地壯藥夜香牛中木犀草素的含量測定

譚小明 周小雷 周雅琴*趙以民 余麗瑩

西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室/廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023

目的：建立高效液相色譜法(HPLC)測定廣西不同產(chǎn)地壯藥夜香牛中木犀草素的含量。方法：采用HPLC法對10個不同產(chǎn)地的夜香牛藥材中木犀草素的含量進行檢測。采用Alltima C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇-乙腈(1∶1)為流動相A；0.5%磷酸為流動相B；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：350 nm。結(jié)果：廣西10個不同產(chǎn)地夜香牛藥材中木犀草素含量在0.00200%～0.00997 %之間。結(jié)論：本實驗方法過程簡單、測定結(jié)果可靠、且檢測的重復(fù)性好，可作為研究壯藥夜香牛質(zhì)量標準的方法。

壯藥；夜香牛；木犀草素；高效液相色譜法；產(chǎn)地

夜香牛[VernoniaCinerea(L.) Less.]屬菊科(Compositae)斑鳩菊屬(Vernonia)一年生或多年生草本植物，廣泛分布于浙江、江西、福建、臺灣、湖北、湖南、廣東、廣西、云南和四川等省區(qū)，印度至中南半島、日本、印度尼西亞、非洲也有，常見于山坡曠野、荒地、田邊、路旁[1]。以干燥全草或根入藥，是壯族習用的藥材，《嶺南采藥錄》早有記載[2-3]；其味苦、辛，性涼，具有清熱疏風、除濕解毒等功效，主治感冒發(fā)熱、黃疸型肝炎及毒蛇咬傷等[4]。藥理研究表明，夜香牛的植物浸提物體外對大腸桿菌等多種人體病原菌具有不同程度的抑制作用，對正常小鼠小腸具有一定的促進推進作用[5]。木犀草素是其主要化學成分之一[6-7]。在廣西，夜香牛分布于全區(qū)各地，各地藥材質(zhì)量存在差異，給臨床用藥帶來一定的影響。因此，本研究以木犀草素含量為指標，考察10個不同產(chǎn)地采集夜香牛藥材中的木犀草素含量，旨在為廣西夜香牛藥材的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 安捷倫1260高效液相色譜系統(tǒng)(包括四元梯度洗脫泵、自動進樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器，美國安捷倫公司)；SK5200H型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，頻率53KHz，功率200W)；CP2250D電子分析天平(Sartorius)；101-1型電熱鼓風干燥箱(上海滬南科學儀器聯(lián)營廠)；W201型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)；高速萬能粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.2 材料 木犀草素對照品(批號 16030941，純度≥98%，同田生物技術(shù)股份有限公司)。甲醇為色譜純(美國Fisher公司)，其他試劑均為分析純。10批夜香牛藥材為廣西南寧、大新、永福、全州等地采集。經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學韋松基教授鑒定為菊科植物夜香牛V.cinerea(L .)干燥的全草。憑證標本存放于廣西藥用植物園中藥資源鑒定中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 色譜柱：Alltima C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A：甲醇-乙腈(1:1)，流動相B：0.5%磷酸，梯度洗脫(30%～60%A，0～30min)；流速1.0 mL/min；檢測波長：350 nm；柱溫：30℃。在上述條件下進行測定，夜香牛樣品中木犀草素峰峰形對稱，與其他組分分離度好，理論塔板數(shù)≥10000，分離度gt;1.5，結(jié)果見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取木犀草素對照品5.66 mg置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成0.2264 mg·mL-1的對照品溶液。精密吸取上述木犀草素儲備液1.5 mL于10mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成每1mL含木犀草素0.03396mg的對照品溶液。

2.2.2 供試樣品液的制備 取夜香牛藥材粉末(過2號篩)約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇40 mL，超聲提取2次，第1次60 min，第2次30 min，過濾，合并濾液，蒸干，用色譜甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶并定容，搖勻，濾過，濾液過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取濃度為0.03396 mg/mL的木犀草素對照品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL，依次注入液相色譜儀，測定峰面積；以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=4636.074X+0.714(r2=0.9998)，結(jié)果表明，木犀草素在0.06792～0.47544 μg與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗 精密吸取木犀草素對照品溶液(質(zhì)量濃度0.03396 mg/mL)8μL，重復(fù)進樣6次，分別測定峰面積，RSD為1.11%(n=6)，結(jié)果表明該儀器精密度良好，儀器性質(zhì)穩(wěn)定，所測樣品數(shù)據(jù)可靠，可用于樣品含量測定。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取夜香牛藥材粉末2g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在于0、2、4、6、8、12 h進樣，測定木犀草素峰面積，其RSD值為1.22%，結(jié)果表明在12h內(nèi)測試樣品穩(wěn)定可靠。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一批藥材粉末6份，每份2 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，根據(jù)含量測定結(jié)果計算RSD為3.11%(n=6)，表明該方法制備供試樣品重現(xiàn)性良好，證明該方法可行。

2.7 回收率試驗 取已知含量的樣品粉末6份，各約1g，精密稱定。分別精密加入濃度為0.03396 mg·mL-1的木犀草素對照品溶液1.6mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，計算回收率。表明本方法的準確度較好。見表1。

表1 夜香牛中木犀草素加樣回收率實驗

2.8 樣品測定 10批夜香牛樣品的含量測定結(jié)果見表2。

表2 夜香牛中木犀草素含量測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

壯藥夜香牛在廣西民間常被用于治療感冒發(fā)熱、黃疸型肝炎、毒蛇咬傷。另外，其70%的提取液對鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤Pc-12細胞具有良好的神經(jīng)生長因子(NGF)誘導(dǎo)活性。化學研究表明，夜香牛全草以黃酮類(如木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、洋芹素等)、倍半萜類和酚類成分為主；根中以甾類和三萜類化合物居多[6-7]。木犀草素的藥理活性研究表明其具有抗菌、抗氧化、抗輻射等多種作用[8]；這與夜香牛的民間藥用功效相互對應(yīng)；此外，夜香牛藥材中的香葉木素和木犀草素-7-O-葡萄糖苷等化學成分也具有抗菌和有利于動物消化系統(tǒng)蠕動的作用[4-5]。綜合夜香牛的化學和藥理作用研究，本研究選擇以木犀草素作為夜香牛含量測定的指標性成分。

在流動相條件優(yōu)化過程中，參考文獻[9]以甲醇-0.2 %磷酸溶液(44∶56)為流動相，但實驗研究中樣品峰干擾的成分較多，各峰分離度達不到分離要求，這可能與檢測儀器和色譜柱的差異有關(guān)。研究通過比較篩選，結(jié)果顯示，用流動相A為甲醇-乙腈(1∶1)，流動相B為0.5%磷酸，梯度洗脫(30%～60%A，0～30min)系統(tǒng)效果較好，木犀草素峰的峰形對稱，且與其他組分分離度好，理論塔板數(shù)較高，因此，選用此系統(tǒng)作為夜香牛中木犀草素含量測定的流動相。

中藥材的質(zhì)量與其生長環(huán)境密切相關(guān)[10]。夜香牛廣泛分布于廣西全區(qū)各地，但是不同產(chǎn)地的夜香牛藥材中木犀草素的含量存在差異。研究所采集的10個產(chǎn)地的夜香牛藥材樣品中，以桂北的廣西恭城縣、灌陽縣和全州縣的夜香牛木犀草素含量最高，分別達到0.00997%、0.00987%和0.00956%；其次是桂西南的廣西那坡縣、靖西縣和大新縣；夜香牛木犀草素含量最低的產(chǎn)地是廣西隆林縣。由此可見，生長環(huán)境對于夜香牛的質(zhì)量也存在一定的影響，但具體是哪些因子產(chǎn)生此類影響，還有待進一步研究。

研究以高效液相色譜法為檢測工具，建立了廣西不同產(chǎn)地夜香牛藥材中主要成分木犀草素的測定方法；較以往的研究方法，具有樣品制作和檢測過程簡單、測定結(jié)果可靠、且檢測的重復(fù)性好，這一方法為壯藥夜香牛中木犀草素的質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)參考，同時也可為其它類似中藥材中木犀草素的含量檢測提供依據(jù)。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會. 中國植物志(第74卷)[M]．北京：科學出版社，1985：38.

[2]江蘇新醫(yī)學院. 中藥大辭典(上冊)[M]. 上海: 上海人民出版社, 1977: 916.

[3]《全國中草藥匯編》編寫組. 全國中草藥匯編(第二版，上冊)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：483.

[4]國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會. 中華本草 [M].上海：上海科學技術(shù)出版社，1999：1000．

[5]李育浩,吳清和,李茹柳,等. 傷寒草藥理研究[J]. 中藥材,1993(5):31-33

[6]朱華旭,唐于平,閔知大,等.夜香牛全草的生物活性化學成分研究(Ⅱ)[J]. 中國中藥雜雜志，2009(21):2765-2767.

[7]朱華旭,唐于平,潘林梅,等.夜香牛全草的生物活性成分研究[J]. 中國中藥雜志,2008(16):1986-1988.

[8]張芳芳, 沈漢明, 朱心強. 木犀草素抗腫瘤作用的研究進展[J]. 浙江大學學報(醫(yī)學版)，2006,35(5): 573-578.

[9]陳黃保. HPLC法測定夜香牛中木犀草素的含量[J]. 中國藥師，2009, 12(9): 1262-1263.

[10]朱波,劉京晶,斯金平,等. 鐵皮石斛內(nèi)生真菌對宿主組培苗生長與代謝成分的影響[J].中國中藥雜志, 2016(9): 1602-1607.

Determination of Luteolin in the Zhuang Medicine Vernonia cinerea (L.) Less. from Different Habitats

TAN Xiaoming ZHOU Xiaolei ZHOU Yaqin*ZHAO Yimin YU Liying

National Engineering Laboratory of Southwest Endangered Medicinal Resources Development,National Development and Reform Commission, Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant, Nanning 530023, China

Objective To determinate the content of luteolin in Zhuang medicineVernoniacinerea(L.) Less. from different habitats of Guangxi by HPLC. Methods The luteolin in ten different habitats ofV.cinereawas dominated by HPLC using Alltima C18chromatographic column (4.6 mm×250 mm，5 μm). Methanol-Acetonitrile(1∶1)and 0.5% phosphoric acid were used as mobile phase，which flowing at 1.0 mL·min-1(with the gradient elution at 30 %～60 %, 0 to 30 min ).The detection wavelength was 350 nm and column temperature was at 30 ℃. Results The content of luteolin in ten different habitats ofV.cinereawas 0.0020 %～0.00997 %. Conclusion The HPLC method for the determination of luteolin contain inV.cinereais simple, accurate and reproducible, which may be used for the study quality standard ofV.cinerea.

Zhuang Medicine；VernoniaCinerea；Luteolin；HPLC；Habitats

R284.1

A

1007-8517(2017)20-0018-03

廣西重大專項計劃資助項目(桂科重1598005-10)；國家自然科學基金資助項目(81360682)；廣西科學基金資助項目(2015GXNSFDA139012 、2016GXNSFBA380007)。

譚小明(1979-)，男，博士研究生，副研究員，研究方向為藥用植物菌根生物學。E-mail:txm1978@126.com

周雅琴(1979-)，女，學士，助理研究員，研究方向為藥物分析。E-mail：zhouyaqin2009@126.com

2017-09-06 編輯：程鵬飛)