壯藥制劑棒柄花葉清肝膠囊的質(zhì)量控制研究

張 穎 劉 元 宋志釗 文志云 韋 韡

1.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022；2.廣西中藥質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣西 南寧 530022

壯藥制劑棒柄花葉清肝膠囊的質(zhì)量控制研究

張 穎1,2劉 元1,2宋志釗1,2文志云1,2韋 韡1,2

1.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022；2.廣西中藥質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣西 南寧 530022

目的：制定壯藥制劑棒柄花葉清肝膠囊的質(zhì)量控制方法。方法：采用TLC法對制劑中虎杖和黃芪進行鑒別；采用HPLC法測定方中虎杖苷含量。結(jié)果：在虎杖薄層色譜中，壯藥制劑棒柄花葉清肝膠囊與大黃素對照品，大黃素甲醚對照品色譜相應(yīng)的位置上，斑點清晰，陰性無干擾，可作為定性鑒別；在黃芪薄層色譜圖中，壯藥制劑棒柄花葉清肝膠囊在與黃芪對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，斑點清晰，陰性無干擾，可作為定性鑒別；HPLC測定虎杖苷在 5.1～163.2 μg范圍內(nèi)與峰面積性關(guān)系良好(r=0.999 8)，平均回收率為 98.8%，RSD為1.64% (n=6)。結(jié)論：建立的質(zhì)量標準可控制壯藥制劑棒柄花葉清肝膠囊的質(zhì)量。

壯藥制劑；大黃素；大黃素甲醚；黃芪；虎杖苷

壯藥制劑棒柄花葉清肝膠囊是廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院自主知識產(chǎn)權(quán)的非標準制劑[1]，由棒柄花葉、白花蛇舌草、虎杖、黃芪4味中藥組成，具有清熱毒、除濕毒、通龍路火路(壯醫(yī)理論)的功效，用于慢性乙型肝炎(肝膽濕熱證)[2]。棒柄花葉清肝膠囊方[3]中棒柄花葉性味苦、寒，具有清熱毒、除濕毒之功效，是壯醫(yī)清除濕毒熱毒、退黃疸之要藥，是為主藥。虎杖味苦，性寒，具有清熱毒、除濕毒之功效；白花蛇舌草味苦、甘，性寒，具有調(diào)龍路、通水道、清熱毒、除濕毒的功效，二藥可加強主藥的作用，是為幫藥。此外，黃芪性味甘溫，具有補氣虛，促生血的作用，既可針對慢性肝炎久病氣血不足而設(shè)，也有防止其余苦寒藥之傷正太過，也起到幫藥的作用。全方僅有4味藥，反映出壯醫(yī)用藥簡、便、廉的特點[4]。為了有效控制制劑質(zhì)量，筆者對其質(zhì)量標準進行了研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 YOKO-ZS型紫外分析攝影儀(武漢藥科新技術(shù)開發(fā)公司)； LC-20ATVP/SPD-20AVP高效液相色譜儀(廣西威瑪龍工作站及軟件5.23版，日本島津)；AL-104型電子天平(梅特勒-托利多(上海)有限公司)；KQ-5200E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 黃芪對照藥材(批號：120974-200609，由中國藥品生物制品檢定院)。大黃素(批號：110756-200110)、大黃素甲醚(批號：110758-200610)、虎杖苷(批號：111575-200502)等對照品均由中國藥品生物制品檢定院；棒柄花葉清肝膠囊(批號：20160601、20160602、20160603，0.4g/粒，廣西醫(yī)科大學(xué)制藥廠)。乙腈為色譜純，液相用水為超純水，甲醇、三氯甲烷、石油醚、甲酸乙酯、甲酸乙醚、石油醚等化學(xué)試劑為分析純。薄層層析硅膠G(板青島海洋化工有限公司產(chǎn)品)。

2 方法與結(jié)果

2.1 虎杖TLC定性鑒別[5]

2.1.1 對照品溶液的制備 取大黃素、大黃素甲醚各加甲醇制成每 1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物 3.0g，加甲醇 20mL，加熱回流 30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加 2.5mol/L硫酸溶液20mL，水浴加熱30min，放冷，用三氯甲烷振搖提取2次，每次 20mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 缺虎杖陰性樣品溶液制備 按壯藥制劑棒柄花葉清肝膠囊處方取缺虎杖的各味藥材，按工藝制法制備缺虎杖的陰性樣品，取3.0g，按照“2.1.2”項下方法制備，即得缺虎杖的陰性樣品溶液。

2.1.4 薄層色譜條件及結(jié)果 照薄層色譜法(中國藥典2015年版通則0502)試驗，吸取上述3種溶液各 4μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外燈365nm下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，而陰性樣品色譜無上述斑點。如圖1所示。

2.2 黃芪TLC定性鑒別

2.2.1 對照藥材溶液的制備 取黃芪對照藥材 0.5 g，按照“2.2.2”項下制成對照藥材溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物 3.0g，加甲醇 20mL，加熱回流30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加 0.3%氫氧化鈉溶液15mL使溶解，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值到5～6，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次 20mL，合并乙酸乙酯，用水振搖提取2次，每次 20mL，乙酸乙酯液蒸干，殘渣加甲醇 1mL使溶解，作為供試品溶液。

2.2.3 薄層色譜條件及結(jié)果 照薄層色譜法(中國藥典2015年版通則0502)試驗，吸取吸取上述2種溶液各3～5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(10∶1)為展開劑展開，取出，晾干，置于紫外燈254nm下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，而陰性樣品色譜無上述斑點。如圖2所示。

2.3 含量測定

2.3.1 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物研細并混勻，取0.3g，精密稱定，25mL量瓶中，加稀乙醇20mL，超聲處理30min(頻率28kHz、功率100W)，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取虎杖苷對照品 10.2mg，置 25mL量瓶中，用稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成 408mg/L虎杖苷對照品儲備液，備用。精密量取虎杖苷對照品儲備液1.0mL，置10mL量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，得40.8mg/L對照品溶液。

2.3.3 缺虎杖陰性樣品溶液制備 按棒柄花葉清肝膠囊處方取缺虎杖的各味藥材，按工藝制法制備缺虎杖的陰性樣品，取0.3g，按照供“2.3.1”項下方法制備，即得缺虎杖的陰性樣品溶液。

2.3.4 色譜條件及系統(tǒng)適用性 Intersil-C18柱( 4.6mm×250mm，5μm)；乙腈-水溶液(20∶80)為流動相；306nm作為檢測波長；1.0mL/min流速；室溫；理論板數(shù)按虎杖苷峰計算應(yīng)不低于3000。

2.3.5 標準曲線考察 分別精密吸取虎杖苷對照品儲備液 0.5、1.0、2.0、4.0mL，分別置10mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成20.4mg/L、40.8mg/L、81.6mg/L、163.2mg/L虎杖苷對照品溶液，分別精密吸取20.4mg/L虎杖苷對照品溶液2.5、5、10μL及40.8mg/L、81.6mg/L、163.2mg/L虎杖苷對照品溶液各10μL，按“2.3.4”項下色譜條件分別進樣，測定，計算，得回歸方程為：Y=17137X+25921，r=0.9998。結(jié)果表明，虎杖苷進樣濃度在5.1～163.2μg/mL之間與峰面積積分值線性關(guān)系

2.3.6 專屬性試驗 分別精密吸取“2.3.1～2.3.3”項下對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果陰性樣品溶液在與對照色譜相同保留時間的位置上未顯色譜峰，表明對被測成分無干擾。如圖3所示。

2.3.7 精密度的考察 分別精密吸取按“2.3.1”項下方法制備的供試品溶液(批號20160601)和“2.3.2”項下對照品溶液各10μL，照“2.3.4”項下方法連續(xù)進樣，測定峰面積值6次，對照品及供試品溶液中虎杖苷色譜峰峰面積RSD值分別為1.50%、1.28%。

2.3.8 穩(wěn)定性的考察 取同一樣品(批號20160601)，按“2.3.1”項下方法制備，于制備后0、4、8、12、24h，按照“2.3.4”項下方法分別測定峰面積，計算峰面積RSD值為 1.40%。表明供試品溶液在16 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.3.9 重復(fù)性的考察 取同一批樣品(批號20160601)，按“2.3.1”項下方法制備6份樣品溶液，照“2.3.4”項下方法分別測定其峰面積，計算。結(jié)果測得虎杖苷含量為每粒0.783mg，RSD值為1.35%，說明本方法重復(fù)性好。

2.3.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量(每粒0.783mg)的樣品(批號20160601)內(nèi)容物約0.15g6份，分別置6個具塞錐形瓶中，精密加入408mg/L虎杖苷對照品儲備液溶液0.72mL，按“2.3.1”項下的方法提取，按照“2.3.4”項下方法測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1，虎杖苷平均回收率為98.8%，RSD為1.64%。

2.3.11 樣品含量測定 取批號分別為20160601、20160602、20160603的樣品各2份，按照“2.3.4”項下的方法，分別制備樣品溶液，進行測定，虎杖苷含量分別為每粒0.718、0.736、0.730。

3 討論

本文參考《廣西醫(yī)療機構(gòu)中藥民族藥制劑標準(第一卷)》質(zhì)量標準起草說明細則的要求，對棒柄花葉清肝膠囊各藥味進行摸索研究。應(yīng)用TLC法對棒柄花葉進行鑒別，所用作對照的藥材為廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所鑒定(批號150406)，但中檢院暫無棒柄花葉對照藥材提供，因此未收入標準正文。對處方中白花蛇舌草進行TLC鑒別[4]，結(jié)果在供試品色譜中與白花蛇舌草對照藥材、齊墩果酸對照品相應(yīng)的位置上，沒有顯相同顏色的斑點。故擬定標準正文中不采用。在虎杖(大黃素、大黃素甲醚)、黃芪的薄層實驗中，均進行了系統(tǒng)適應(yīng)性考察，結(jié)果展開條件不同的溫度(10℃、25℃、35℃)、不同的濕度(35%、70%、90%)對正文擬定方法無明顯影響。

表1 加樣回收試驗 (n=6)

(續(xù)表)

表1 加樣回收試驗 (n=6)

制劑質(zhì)量標準中含量測定項下，曾考慮過測定棒柄花苷A(棒柄花葉)的含量。棒柄花苷A被視為棒柄花葉的質(zhì)控指標[6]，也用于棒柄花葉最佳采收期的確定，在棒柄花葉的含量中最高可達0.149%[7]。但是棒柄花葉只能野外收集，沒有市售。如果采用棒柄花苷A作為質(zhì)控指標，經(jīng)提純檢測后，方能作為對照品使用，制劑檢驗必然成本大增。故雖已有方法從棒柄花葉中制備高純度棒柄花苷A[8]，考慮到本文是對醫(yī)療機構(gòu)制劑進行質(zhì)量控制研究，故暫未考慮對其開展。在虎杖苷(虎杖)的研究中，考察了乙醇、稀乙醇、30%乙醇作為提取溶劑，不同提取方法，超聲、加熱回流和索氏提取中虎杖苷的含量。結(jié)果表明稀乙醇25mL(比較了10、25、50mL)作為提取劑，超聲處理30min(比較了15、30、45min)，效果最好，故選之。

本文建立了棒柄花葉清肝膠囊的薄層鑒定和含量測定，可收入棒柄花葉清肝膠囊質(zhì)量標準中，作為該制劑的質(zhì)量控制手段。

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Studies on Quality Control Standards of Zhuang Medicine Bangbinghuaye Qinggan Jiaonang

ZHANG Ying1，2LIU Yuan1，2SONG Zhizhao1，2WEN Zhiyun1，2WEI Wei1，2

1.Guangxi Institute for Chinese Medicine amp; Pharmaceutical Science, Nanning 530022，China；2.Guangxi Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Standards, Nanning 530022，China

Objective To set up studies on quality control standards of Zhuang Medicine Bangbinghuaye qinggan jiaonang．Methods Polygonum Cuspidatum and Astragalus membranaceus were identified by TLC.The content of Polydatin was determined by HPLC.Results TLC spots of Polygonum Cuspidatum and Astragalus membranaceus were clear and negative without interference，which can be used as qualitative method． The calibration curves were linear in the range of 5.1～163.2μg for Polydatinr=0.9998, average recovery of Bergenin was 98.8%,RSDwas 1.64%(n=6). Conclusion The quality of Zhuang Medicine Bangbinghuaye qinggan jiaonang was effectively controlled by these quality standards.

Zhuang Medicine；Emodin；Emodin Nonomethyl Ether；Astragalus Membranaceus；Polydatin

R29

A

1007-8517(2017)20-0038-04

張穎(1986-)，女，漢族，本科，助理研究員，研究方向為質(zhì)量標準與新產(chǎn)品開發(fā)。E-mail：zhying2010@qq.com

2017-09-07 編輯：穆麗華)