Pyrrosia petiolosa酯提物抗氧化活性檢測及其活性物質研究

陳 沖，成 娟，李彩云，易思君，李寧浙，彭靜珊，侯若彤，趙 建

（四川大學生命科學學院資源微生物及生物技術重點實驗室，四川 成都 610064）

Pyrrosia petiolosa酯提物抗氧化活性檢測及其活性物質研究

陳 沖，成 娟，李彩云，易思君，李寧浙，彭靜珊，侯若彤，趙 建

（四川大學生命科學學院資源微生物及生物技術重點實驗室，四川 成都 610064）

探究有柄石韋（Pyrrosia petiolosa）酯提物的抗氧化活性及其活性物質，為P.petiolosa的開發應用提供依據。采用乙酸乙酯提取P.petiolosa；采用鐵氰化鉀還原法、水楊酸法、DPPH法、ABTS法和鄰苯三酚自氧化法，分別測定P.petiolosa酯提物的還原能力以及對羥自由基、DPPH自由基、ABTS·+自由基和超氧陰離子自由基的清除率；并進一步利用GC-MS對酯提物進行活性成分檢測。P.petiolosa酯提物的還原能力，對羥自由基、DPPH自由基、ABTS·+自由基和超氧陰離子自由基的清除作用均與濃度呈正相關。GC-MS結果表明：P.petiolosa酯提物的抗氧化活性成分主要為乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷（19.54%）、2，2′-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（11.96%）、2-甲氧基-3-（2-丙基）苯酚（0.91%）。P.petiolosa酯提物具有較強的抗氧化活性，有較大的開發利用前景。

有柄石韋；酯提物；抗氧化活性；檢測；GC-MS

0 引 言

自由基是生物體在代謝活動中產生的物質，當自由基產生過量時，會導致細胞內糖類、脂質、蛋白質、核苷酸等代謝異常，進而引起腫瘤、心血管、炎癥等疾病或衰老現象[1-2]。當前，人們常用的叔丁基對苯二酚（TBHQ）、2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）、丁基羥基茴香醚（BHA）等人工合成的抗氧化劑雖然具有一定的抗氧化效果，但是價格昂貴而且存在一定的安全隱患[3]。因此，尋找安全、高效的天然抗氧化劑具有十分重要的意義。Ammar[4]研究報道迷迭香萃取物具有較強的抗氧化能力，是TBHQ良好的潛在替代劑；An等[5]研究發現順序提取酶解木質素能增強其抗氧化性能，效果接近于BHT；張昊等[6]研究發現：山丹鱗莖中總黃酮對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基的清除能力均強于BHT。這些研究都表明，以天然植物作為提取天然抗氧化劑的資源，符合現代觀念，具有廣闊的發展和應用前景。

有柄石韋（Pyrrosia petiolosa）在分類上屬于水龍骨科（Polypodiaceae）石韋屬植物。作為一種傳統的中藥，其味甘、苦，性微寒，具有利水通淋、清肺瀉熱、止血等作用[7]。《本草綱目》和《中國藥典》中記載，P.petiolosa常用于氣管炎、泌尿系結石、尿血、肺熱咳喘等疾病的治療[8]。在現代醫學研究中表明，P.petiolosa提取物在抑菌、抗氧化、抗炎利尿、增強免疫力等方面同樣具有顯著療效[9]。

目前對于P.petiolosa的研究主要集中在化學活性成分和抑菌等方面，程丹丹等[10]通過HPLC指紋圖譜、紅外光譜等分析P.petiolosa葉片的化學活性成分，表明P.petiolosa含有蒽醌類、黃酮類、萜類、類固醇、皂苷、酚類和還原糖等成分；在前期實驗中本課題組從P.petiolosa葉中分離出一種內生真菌S-34，研究發現其發酵上清液與菌體的乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌等常見的供試病原細菌均具有明顯的抑制作用[11]。對P.petiolosa葉提取物抗氧化性研究相對較少，Cao等[12]研究發現P.petiolosa葉具有很強的清除自由基和超氧陰離子能力，同時表現出對乙酰膽堿酯酶的抑制活性；丁文慧等[13]用乙醇提取P.petiolosa葉，結果表明醇提取具有很好的抗氧化性。但是對于P.petiolosa乙酸乙酯提取物抗氧化活性的測定及研究未見報道。許海棠等[14]用4種不同溶劑提取青天葵，研究顯示乙酸乙酯提取物抗氧化性最強，乙醇提取物最弱；而李本杰等[15]研究表明霸王花乙酸乙酯提取物體外抗氧化和抗菌活性最優，高于乙醇提取物；此外，還有文獻報道乙醇提取物乙酸乙酯部位黃酮、總酚含量最高，抗氧化活性最強[16-17]。本文在前人研究的基礎上，選擇乙酸乙酯提取P.petiolosa，采用還原能力檢測、羥自由基清除測定、DPPH自由基清除測定、ABTS·+自由基和超氧陰離子自由基清除測定的方法來檢測P.petiolosa葉酯提物的抗氧化活性，并通過GC-MS對其有效的抗氧化成分進行初步研究，為P.petiolosa的進一步臨床開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

P.petiolosa植株葉片于2016年8月從四川省阿壩藏族羌族自治州汶川縣采摘，由四川大學生命科學學院鑒定，在4℃條件保存備用。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯乙酸、過硫酸鉀均為分析純，購自成都金山化學試劑有限公司；H2O2、三氯化鐵、鄰苯三酚均為分析純，購自成都市科龍化工試劑廠；鐵氰化鉀為化學純，購自成都化學試劑廠；抗壞血酸為分析純，購自天津博迪化工股份有限公司；水楊酸為化學純，購自成都市科龍化工試劑廠；DPPH為分析純，購自Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2.2 儀 器

分析天平（上海民橋精密儀器科技有限公司，SL502N）；電熱恒溫三孔水浴鍋（上海躍進醫療器械有限公司，DK-8D）；pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司，PHS-25）；旋轉蒸發儀(上海申順生物科技有限公司，R-201)；紫外可見光光度計（SHIMADZU，UV-2600）；氣相色譜-質譜聯用儀（日本島津公司，QP2010）。

1.3 方 法

1.3.1 樣品處理

P.petiolosa葉放置陰干，取500g，剪碎，經石油醚冷浸過夜后抽濾。殘渣加入1000mL乙酸乙酯，40℃提取72h后，抽濾，濾液減壓濃縮至浸膏蒸干。由石油醚將水浴后的浸膏再次萃取至無色，然后蒸干得酯提物，用250 mL水溶解備用，提取液濃度相當于 2g（原葉干重）/mL。

1.3.2 還原能力測定

參照陳鶯鶯[18]的方法。分別取1mL不同質量濃度的樣品溶液，加入2.5mL 0.2moL/L的磷酸緩沖液以及等體積1%的 K3Fe（CN）6，混合均勻，在 50℃恒溫水浴中反應20 min后，快速冷卻，然后加入10%的三氯乙酸溶液2.5mL，充分混勻，3000r/min離心10min。依次吸取2.5mL上清液和等體積的高純水，以及0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，室溫靜置10 min，然后在波長700nm處測定吸光值，3次平行實驗后取平均值。

1.3.3 羥自由基清除能力的測定

參照張夏輝[19]的方法。取1mL不同質量濃度的樣品溶液，依次加入2mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L水楊酸溶液各3mL，充分搖勻，然后加入3mL 1mmol/L的H2O2溶液，在37℃恒溫水浴中靜置反應30min后取出，在510nm波長處測定吸光度（Ai）。陰性對照組（Ao）以蒸餾水代替樣液，同時，以抗壞血酸為陽性對照。3次平行實驗后取平均值，羥自由基清除率計算公式為

1.3.4 DPPH自由基清除測定

參照馬承慧等[20]的方法。分別吸取1mL不同濃度的樣品溶液，加入0.1 mmol/L DPPH溶液3 mL混勻，室溫遮光靜置30 min后，于波長517nm處測定反應液的吸光度（Ai）。陰性對照組（Ao）用無水乙醇來代替樣液，而以無水乙醇代替DPPH溶液作為空白組（Aj），同時，以抗壞血酸作為陽性對照。3次平行實驗后取平均值，樣品對DPPH的清除率計算公式如下：

1.3.5 ABTS·+自由基清除測定

參照李培源等[21]的方法。用70mmol/L的過硫酸鉀溶液溶解ABTS粉末，混合均勻，避光放置12～16h，得到 2mol/L的 ABTS·+母液，備用。使用前將ABTS·+母液用磷酸鹽緩沖液稀釋至734 nm的吸光值Ao=0.70±0.02。將樣品溶液稀釋為9個不同濃度，分別取40μL的樣品溶液，加入4mL ABTS·+工作液并混勻，在30℃恒溫水浴中靜置6min，然后在波長734nm處測定吸光度Ai，以抗壞血酸為陽性對照。3次平行實驗后取平均值，其清除率（S）計算公式如下：

1.3.6 超氧陰離子自由基清除測定

參照韋霄等[22]的方法。取6支試管，分別加入4.5mL Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2），在 20℃水浴中預熱20min后，依次加入4.2mL不同濃度的樣液和0.5 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混合均勻后在25℃恒溫水浴中反應5 min，最后加入1 mL 8 mol/L HCl溶液來終止反應，于325nm波長處測定吸光度Ai，以蒸餾水代替樣品溶液作為陰性對照Ao，以抗壞血酸作陽性對照。3次平行實驗后取平均值，按下式計算清除率：

1.3.7 P.petiolosa葉酯提物的GC-MS檢測

采用GC-MS對干葉的酯提物進行檢測，對其抗氧化成分進行初步探究。GC-MS條件：柱箱溫度50℃；進樣溫度280℃；壓力53.5kPa；采用分流進樣；分流比：20∶1；總流量 14.0 mL/min；柱流量：1.00 mL/min；線速度：36.3cm/s；吹掃流量：3.0mL/min；溫度程序：初始 50℃保持 5 min，以 10℃/min升至150℃，保持 5 min，以 5℃/min升至 280℃，保持8min；以3℃/min升至300℃，保持10min。以乙酸乙酯作為空白。

2 結果與分析

2.1 還原能力測定

采用鐵氰化鉀還原法來測定還原能力，以鐵氰化鉀為氧化劑，與樣液反應后Fe3+被還原成Fe2+，同時反應體系顏色發生變化。在700nm波長處檢測吸光度值，吸光度越大，表示樣品的還原力越強，其抗氧化性越佳。圖1表明，隨著樣液濃度的增大，吸光值逐漸增強，說明P.petiolosa酯提物具有良好的供電能力，可以使 Fe3+還原成 Fe2+，具有一定的還原能力。

2.2 羥自由基清除能力的測定

由圖2可知，P.petiolosa酯提物對羥自由基具有一定的清除能力，清除率隨提取物濃度的增加而增大，基本呈線性關系。在提取物濃度達到0.2g（原葉干重）/mL以后，清除率可達到11.6%以上。

2.3 清除DPPH能力的測定

如圖3所示，P.petiolosa酯提物對DPPH自由基的清除率較高，與提取物濃度呈正相關，具有較強的清除能力。提取物溶度增大到一定程度時，清除率呈穩定增加狀態，上升幅度變化不大。當酯提物濃度為0.1g（原葉干重）/mL時，清除率達到92.9%。

圖1 P.petiolosa干葉酯提物的還原能力

圖2 P.petiolosa干葉酯提物和Vc對羥自由基清除能力

2.4 ABTS·＋自由基清除能力測定

當存在酚類等具有供氫能力的抗氧化劑時，ABTS·+自由基能夠與之反應，從而導致反應體系變為無色。因而，可以根據ABTS體系在734nm波長處吸光度的變化來反映物質的氧還能力。由圖4可見，P.petiolosa酯提物和Vc對ABTS·+自由基都表現出一定的清除效果，清除率隨濃度的增大先升高后平穩。提取物濃度較低時，對ABTS·+自由基的清除率較低，約為7.8%～15.9%；提取物濃度達到0.1g（原葉干重）/mL時，清除率可達31.3%，表明P.petiolosa酯提物具有較好的ABTS·+自由基清除能力。

2.5 清除超氧陰離子自由基測定

圖3 P.petiolosa干葉酯提物和Vc對DPPH自由基清除能力

圖4 P.petiolosa干葉酯提物和Vc對ABTS·+自由基清除能力

圖5 顯示，在一定范圍內，對超氧陰離子自由基的清除率隨著提取物濃度的升高逐漸增大，清除效果與樣品濃度存在一定的量效關系。樣品濃度在0.8g（原葉干重）/mL時，其清除率約為47.4%；當樣品濃度為1g（原葉干重）/mL時，清除率達71.84%，表明P.petiolosa干葉酯提物對超氧陰離子自由基具有較好的清除作用。

圖5 P.petiolosa干葉酯提物和Vc對超氧陰離子自由基清除能力

2.6 P.petiolosa酯提物的GC-MS檢測與分析

P.petiolosa酯提物經GC-MS檢測出6類物質、24種化合物，其主要抗氧化活性成分檢測結果見表1。由表可知，酯提物中抗氧化活性成分主要為糖苷類和酚類化合物，分別占酯提物的21.29%、12.87%。

3 討 論

目前對于P.petiolosa的研究主要集中在對腎炎、泌尿系結石、尿血等疾病的治療上，對其葉片酯提物抗氧化性研究未見報道。不同溶劑對植物抗氧化活性成分提取存在差異，有文獻報道乙酸乙酯提取物抗氧化能力強于乙醇提取物[23]，同時乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位抗氧化活性最高[24]。本研究選擇乙酸乙酯提取P.petiolosa干葉，通過還原能力檢測、羥自由基、DPPH自由基、ABTS·＋自由基和超氧陰離子自由基清除測定，對酯提物抗氧還活性進行初步研究。本實驗抗氧化結果與醇提物抗氧化活性結果存在一定差異[13]，原因可能在于醇提物為P.petiolosa精提物，單位濃度抗氧化活性成分相對較高，而本實驗采用的是乙酸乙酯粗提物，單位濃度抗氧化活性成分相對較低，這對于衡量抗氧化能力的強弱存在影響。但研究結果仍表明，P.petiolosa酯提物對羥自由基、DPPH自由基、ABTS·＋自由基和超氧陰離子自由基均有較強的清除效果，且清除效果隨提取物濃度的增加而加強，說明P.petiolosa提取物具有良好的抗氧化性，具有廣闊的應用前景。此外，丁文慧等只是初步研究了抗氧化活性，并未對活性成分進行分析；而本實驗GC-MS結果表明P.petiolosa酯提物以糖苷類、酚類所含化合物種類最為豐富，乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷（19.54%）和 2，2′-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（11.96%）含量最多。

表1 P.petiolosa干葉酯提物抗氧化活性成分檢測結果

目前已有研究從荔枝核[25]、桃仁95%乙醇提取物[26]中分離得到乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷，但在P.petiolosa中屬于首次報道。乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷化學結構含有抗氧化活性的酚羥基，與文獻報道中植物抗氧化性與其酚類含量和酚羥基的數量呈正相關[27-28]的結果一致。2，2′-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚），是一種天然雙酚類抗氧化劑，在天然橡膠、聚乙烯、聚丙烯等方面應用廣泛。劉濤等[29]通過GC-MS從丁岙楊梅果實提取物中檢測到2，2′-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚），而前期實驗中在內生真菌提取物[11]中也檢測到2，2′-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）。這表明P.petiolosa酯提物中豐富的糖苷類、酚類物質與其良好的抗氧化性有關，為P.petiolosa的進一步研究和臨床應用提供理論依據。

4 結束語

作為一種傳統中藥，P.petiolosa具有利水通淋、清肺瀉熱、止血、抑菌等功效。本研究通過不同方法檢測P.petiolosa酯提物抗氧化活性，并用GC-MS對酯提物進行活性成分檢測分析，結果表明P.petiolosa酯提物具有良好的抗氧化性，抗氧化性與其豐富的糖苷類、酚類物質有關，為P.petiolosa進一步合理開發和臨床應用提供理論依據。

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（編輯：莫婕）

Antioxidant activity detection and active substances research of ester extracts in Pyrrosia petiolosa

CHEN Chong， CHENG Juan， LI Caiyun， YI Sijun， LI Ningzhe， PENG Jingshan，HOU Ruotong，ZHAO Jian
（Key Laboratory of Microbiological Resource and Technology，College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China）

The antioxidant activity and active substances of the ester extraction of Pyrrosia petiolosa were studied in order to provide references for further development and utilization.P.petiolosa was extract with ethyl acetate； the reducing power， clearance effects on hydroxyl radical， DPPH radical， ABTS·+radical and superoxide anion free radical were determined using Potassium ferricyanide reduction method， salicylic acid method， DPPH method， ABTS method and pyrogallol autoxidation method，and the ester extraction was further studied by GC-MS.The clearance effect of the ester extraction of P.petiolosa on reducing power， hydroxyl radical， DPPH radical，ABTS·+radical， and superoxide anion free radical showed positive correlation with the concentra-tion.The results through GC-MS showed that the main antioxidant activity of the ester extraction of P.petiolosa were Ethyl β-D-glucopyranoside （19.54% ）， 2， 2′-methylenebis[6-（1， 1-dimethylethyl）-4-methyl-Phenol（11.96%），2-methoxy-3-（2-propenyl）-Phenol（0.91%）).It indicated that the ester extraction of P.petiolosa had strong antioxidant activity，with larger development and utilization prospects.

P.petiolosa； ethyl acetate extract； antioxidant activity； detection； GC-MS

A

1674-5124（2017）09-0068-06

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.09.013

2017-02-04；

2017-03-17

四川省重點研發項目（2017FZ0059）；教育部新世紀優秀人才支持計劃（NCET-13-0397）

陳 沖（1992-），男，湖北荊州市人，碩士研究生，專業方向為資源微生物應用。

趙 建（1976-），男，江蘇揚州市人，教授，博士，主要從事資源微生物及微生物天然免疫研究。