一株小核菌多糖高產菌及其發酵特征

張永剛，董學前，王 偉，張艷敏

(山東省食品發酵工業研究設計院，山東 濟南 250013)

一株小核菌多糖高產菌及其發酵特征

張永剛，董學前*，王 偉，張艷敏

(山東省食品發酵工業研究設計院，山東 濟南 250013)

從感染白腐病的馬鈴薯中分離篩選了一株高產小核菌多糖菌株，命名為齊整小核菌SCL2010(SclerotiumrolfsiiSCL2010)，對菌株SCL2010發酵培養基的碳源、有機氮源進行優化，并對發酵過程中pH值的變化進行了研究。結果表明，以葡萄糖為碳源、玉米漿為有機氮源對菌株SCL2010進行發酵，小核菌多糖的產量、碳源轉化率和產物合成速率分別達到28 g·L-1、56%和0.39 g·L-1·h-1，顯著高于已有研究報道。在發酵產小核菌多糖的過程中，其pH值的變化與已有研究報道顯著不同：其pH值從發酵開始迅速下降至3.0以下后開始緩慢上升至3.5～4.0；如果控制pH值則使小核菌多糖的產量顯著降低，而草酸含量升高，以此推測小核菌多糖的合成可能與pH值的變化有關，后續將進行深入研究。

小核菌多糖；齊整小核菌；高產菌株；發酵特征

小核菌多糖(scleroglucan)是由絲狀真菌齊整小核菌產生的非離子水溶性胞外多糖。其分子由含有β-D-(1,6)-葡萄糖殘基側鏈的線性β-D-(1，3)-葡萄糖殘基鏈組成。小核菌多糖具有良好的流變性、耐酸堿(pH 1～12)、礦化度適應性強(0～200 000 mg·L-1)、耐高溫(130 ℃)[1-2]，在食品與石油工業具有潛在的應用價值。小核菌多糖能提高原油采收率，在當前普遍進入三次、四次采油的趨勢下，具有廣闊的市場前景。但是小核菌多糖的產量不高使其價格居高不下，嚴重限制了其市場發展。因此，提高小核菌多糖的產量是目前的研究重點。目前，主要通過優化培養基、發酵條件、發酵罐設計以及高產菌株誘變等方法實現小核菌多糖高產的目的[3]。

從感染白腐病的馬鈴薯中分離篩選出一株顯著高產小核菌多糖的絲狀真菌，通過18S rDNA序列比對分析，該菌株屬于齊整小核菌，命名為齊整小核菌SCL2010(SclerotiumrolfsiiSCL2010)。為提高小核菌多糖的發酵產量，對菌株SCL2010發酵培養基的碳源和有機氮源進行了優化，并研究了該菌株發酵過程中pH值的變化規律。

1 實驗

1.1 菌種和培養基

齊整小核菌SCL2010(SclerotiumrolfsiiSCL2010),保藏于中國典型微生物保藏中心(CCTCC No.M 2014325)。

基本發酵培養基(g·L-1)：葡萄糖50.0，酵母膏2.0，NaNO32.0，K2HPO4·3H2O 1.0，檸檬酸0.7，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，pH值4.5。

1.2 方法

1.2.1 發酵過程

搖瓶發酵：500 mL搖瓶裝液量80 mL，接種量10%，發酵溫度28 ℃，搖床轉速300 r·min-1。

10 L發酵罐發酵：裝液量7 L，接種量10%，發酵溫度28 ℃，攪拌轉速350 r·min-1。

1.2.2 小核菌多糖產量和生物量的測定

取10 mL發酵液中和，用蒸餾水稀釋3～4倍，80 ℃水浴30 min，均質1～2 min后10 000g離心30 min。上清液加2倍體積的95%乙醇沉淀小核菌多糖，過濾，再用95%乙醇洗滌，所得沉淀于105 ℃干燥，稱重，測定小核菌多糖產量。離心所得沉淀用蒸餾水重溶洗滌后10 000g離心30 min，所得沉淀于105 ℃干燥，稱重即為生物量。

1.2.3 發酵液表觀黏度與1.0%(質量體積比，下同)多糖溶液黏度的測定

發酵液表觀黏度采用NDJ-1型黏度計、4號轉子、60 r·min-1、25 ℃測定。

1.0%多糖溶液黏度采用NDJ-1型黏度計、3號轉子、60 r·min-1、25 ℃測定。

1.2.4 發酵液殘糖含量的測定

采用費林法測定以淀粉和葡萄糖為碳源時的殘糖含量。采用紫外分光光度法測定以蔗糖為碳源時的殘糖含量。

1.2.5 發酵液草酸含量的測定(HPLC法)

色譜條件：Shimadzu/Agilent 1100 液相分析系統，G1311A 四元泵，示差折光檢測器(RID)，進樣量為10 μL；Agilent HPLC 2D色譜工作站；色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H多孔陰離子交換柱(7.8 mm×300 mm)，柱溫為55 ℃，流動相為10 mmol·L-1H2SO4，流速為0.4 mL·min-1。以保留時間定性，外標法定量。

樣品處理：沸水浴10 min，12 000g離心10 min，經0.22 μm水相濾膜過濾。

2 結果與討論

目前關于小核菌多糖發酵生產的相關研究所采用的菌株主要有SclerotiumrolfsiiATCC 201126、ATCC 15205、MTCC 2156，發酵培養基成分基本相同，碳源為蔗糖，有機氮源為酵母膏，發酵產量多在20 g·L-1左右[4-6]。

2.1 碳源對發酵產小核菌多糖的影響

分別采用淀粉、蔗糖、葡萄糖作為菌株發酵培養基的碳源，濃度均為50 g·L-1，發酵時間為72 h，結果見圖1。

圖1 碳源對發酵產小核菌多糖的影響Fig.1 Effect of carbon source on fermentativescleroglucan production

由圖1可以看出，以淀粉為碳源時，小核菌多糖的產量高達30 g·L-1，但產生的多糖黏度較低，即平均分子量低，分子鏈短；以葡萄糖為碳源時，小核菌多糖的產量(28 g·L-1)和黏度都較高；而以蔗糖為碳源時,多糖產量較低，僅為22 g·L-1左右，這與目前大量以蔗糖為碳源發酵產小核菌多糖的研究結果基本吻合。Faria等[4]采用150 g·L-1蔗糖為碳源，小核菌多糖的產量達到28 g·L-1，雖然產量高但碳源轉化率遠低于本研究中以淀粉和葡萄糖為碳源的碳源轉化率。綜合考慮，選擇適宜碳源為葡萄糖。

進一步研究葡萄糖濃度對發酵產小核菌多糖的影響，結果見圖2。

由圖2可以看出，隨著葡萄糖濃度的增大，小核菌多糖產量呈上升趨勢，但當葡萄糖濃度超過50 g·L-1后，碳源轉化率開始下降，殘糖含量上升顯著。因此，該菌株發酵產小核菌多糖適宜碳源濃度為50 g·L-1，小核菌多糖產量達到28 g·L-1以上，碳源轉化率達到56%。

圖2 葡萄糖濃度對發酵產小核菌多糖的影響Fig.2 Effect of glucose concentration onfermentative scleroglucan production

2.2 有機氮源對發酵產小核菌多糖的影響

分別采用酵母膏、玉米漿、蛋白胨、大豆蛋白胨、水解豆粉作為菌株發酵培養基的有機氮源，濃度均為1 g·L-1，發酵時間為72 h，結果見圖3。

圖3 有機氮源對發酵產小核菌多糖的影響Fig.3 Effect of organic nitrogen source onfermentative scleroglucan production

由圖3可以看出，以玉米漿為有機氮源時，小核菌多糖產量和菌體生物量均高于其它4種有機氮源，而有機氮源的種類對1.0%多糖溶液的黏度影響并不明顯，即不影響產品質量。綜合考慮，選擇適宜的有機氮源為玉米漿。

進一步研究玉米漿濃度對發酵產小核菌多糖的影響，結果見圖4。

從圖4可以看出，隨著玉米漿濃度的增大，菌體生物量呈上升趨勢；小核菌多糖產量在玉米漿濃度超過1.0 g·L-1后變化不明顯；當玉米漿濃度超過2.0 g·L-1后，小核菌多糖的產量開始下降。因此，玉米漿適宜濃度為1.0 g·L-1。

圖4 玉米漿濃度對發酵產小核菌多糖的影響Fig.4 Effect of corn steep liquor concentration onfermentative scleroglucan production

2.3 發酵特征

圖5、6為菌株SCL2010的10 L發酵罐發酵過程曲線。

圖5 發酵產小核菌多糖過程中生物量、殘糖含量和多糖產量變化Fig.5 Changes of biomass，residual sugar content,and polysaccharide production in the process offermentative scleroglucon production

圖6 發酵產小核菌多糖過程中pH值、發酵液表觀黏度和草酸含量變化Fig.6 Changes of pH value,fermentation broth viscosity,and oxalic acid content in the process offermentative scleroglucan production

從圖5、6可以看出，小核菌多糖與菌株的生長具有一定相關性，在發酵前期(0～24 h)pH值迅速降低，但小核菌多糖產量和生物量增加緩慢，葡萄糖消耗速率較慢；到發酵中期(24～56 h)后，小核菌多糖產量和生物量迅速增加，葡萄糖迅速消耗，草酸大量生成，但pH值上升緩慢，發酵液表觀黏度隨著小核菌多糖的積累迅速上升；在發酵后期各參數變化趨緩。小核菌多糖的最高產量(28 g·L-1)顯著高于已有研究報道。大量研究表明[4-6]，發酵產小核菌多糖的過程中pH值的自然變化是由初始4.5逐漸降低至2.0左右；但在菌株SCL2010發酵產小核菌多糖過程中，pH值下降至2.8(30 h)左右后，開始緩慢回升，直至發酵結束，可達到3.8左右(圖6)。菌株SCL2010發酵過程中pH值的變化和其它菌株顯著不同，推測這一獨特的pH值變化過程可能是該菌株高產小核菌多糖的主要原因。

2.4 pH值變化與小核菌多糖的高產

pH值對菌體內生物酶的活性影響顯著。在小核菌多糖發酵過程中pH值對菌體生長和小核菌多糖的生物合成均有顯著影響。有研究表明pH值為2時對菌體生長有利，而pH值為4.5時對小核菌多糖的生物合成具有促進效果[7]。在pH值上升期，控制發酵液pH值維持在不同值(2.0、2.5、3.0、3.5、3.8、4.0)，以pH值自然變化作為對照，考察pH值對發酵產小核菌多糖的影響，結果見圖7。

圖7 不同pH值對發酵產小核菌多糖的影響Fig.7 Effect of different pH values onfermentative scleroglucan production

由圖7可以看出，pH值在3.5和3.8時小核菌多糖產量較高，但仍低于自然pH值變化的發酵產量水平，且合成了較多的草酸。原因有待于通過代謝流分

析實驗進一步研究。

3 結論

菌株SclerotiumrolfsiiSCL2010是具有顯著特異性的小核菌多糖高產菌，其發酵適宜的碳源和有機氮源分別為葡萄糖和玉米漿。發酵過程的最顯著特征是pH值在發酵前期迅速降至3.0以下，而在進入產糖期后則開始逐漸回升至3.5～4.0，小核菌多糖產量可達28 g·L-1。后續將通過菌株發酵過程中代謝流的變化特征的研究，分析該pH值變化規律的機理，以闡釋pH值變化與該菌株高產小核菌多糖的關系。

[3] SCHMID J,MEYER V,SIEBER V.Scleroglucan：biosynthesis，production and application of a versatile hydrocolloid[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2011，91(4):937-947.

[5] SCHILLING B M,RAU U,MAIER T，et al.Modeling and scale-up of the unsterile scleroglucan production process withSclerotiumrolfsiiATCC 15205[J].Bioprocess Engineering，1999,20(3)：195-201.

[6] SURVASE S A,SAUDAGAR P S,SINGHAL R S.Use of complex media for the production of scleroglucan bySclerotiumrolfsiiMTCC 2156[J].Bioresource Technology，2007，98(7):1509-1512.

AScleroglucanHigh-YieldingStrainandItsFermentationCharacteristics

ZHANG Yong-gang，DONG Xue-qian*，WANG Wei，ZHANG Yan-min

(ShandongFoodFermentIndustryResearchamp;DesignInstitute,Jinan250013，China)

We isolated a scleroglucan high-yielding strain namedSclerotiumrolfsiiSCL2010 from potatoes suffered white rot,optimized carbon source and organic nitrogen source of fermentation medium,and investigated pH value change in the fermentation process.The results showed that，in the fermentation with glucose as a carbon source and corn steep liquor as a nitrogen source，scleroglucan yield，nitrogen source conversion rate，and product synthetic rate were 28 g·L-1,56%,and 0.39 g·L-1·h-1,respectively，which were significantly higher than those of previous studies.Different from the previous studies，the pH value dropped to below 3.0 at the initial stage while rose slowly to 3.5～4.0.When the pH value was controlled at a certain value，the scleroglucan production decreased significantly but the oxalic acid content increased，which revealed the scleroglucan synthesis might be associated with the pH value change,and further study is required.

scleroglucan;Sclerotiumrolfsii;high-yielding strain;fermentation characteristics

山東省重點研發計劃項目(2015GGX102015)

2017-07-03

張永剛(1985-)，男，內蒙古突泉人，工程師，研究方向：微生物聚合物發酵生產技術與產業化應用,E-mail：zyg8500@126.com；通訊作者：董學前，研究員,E-mail：dxqn@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.11.005

張永剛，董學前，王偉，等.一株小核菌多糖高產菌及其發酵特征[J].化學與生物工程，2017，34(11)：19-22.

TQ922

A

1672-5425(2017)11-0019-04