載microRNA-148b殼聚糖/透明質酸納米粒制備及鑒定

吳廣升 惠光艷

載microRNA-148b殼聚糖/透明質酸納米粒制備及鑒定

吳廣升 惠光艷

目的制備并評價殼聚糖/透明質酸(CS/HA)納米粒負載microRNA-148b(miR-148b)的效果。方法制備CS/HA/miR-148b納米粒, 用激光納米測量儀和透射電鏡對其粒徑、電位和形態(tài)進行觀察。通過凝膠阻滯實驗觀察CS/HA 納米粒對miR-148b的包載情況。用CCK-8實驗評價CS/HA/miR-148b納米粒對大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs) 的細胞毒性; 轉染實驗和流式細胞術檢測轉染效率。結果CS/HA/miR-148b納米粒呈球形，粒徑為160～370 nm，電位為+15 mV～+41 mV。氮磷比為20可以達到最佳的包封效果。CS/HA/miR-148b納米粒對大鼠MSCs無細胞毒性并且具有較高的轉染效率。結論CS/HA 納米粒可以安全有效地將miR-148b轉染入MSCs中。

微小RNA； 殼聚糖； 納米粒； 間充質干細胞(MSCs)

微小核糖核酸(MicroRNA, miRNA)是一種小的內源性非編碼RNA分子，大約由21～25 個核苷酸組成。miRNA通過翻譯水平抑制或促進目的mRNAs的降解而調節(jié)基因的表達，如miRNA可以調控干細胞的增殖、分化、凋亡及癌變等。miRNA 在干細胞成骨分化過程中發(fā)揮了非常重要的作用，被廣泛應用于骨再生方面的研究[1-3]。然而，極易降解、細胞攝取性差及潛在的免疫源性等缺點限制了miRNA的臨床應用。因此，選擇合適的載體負載miRNA提高細胞轉染效率是目前研究的熱點。

非病毒性基因載藥系統(tǒng)，如殼聚糖/透明質酸(chitosan/hyaluronic acid, CS/HA)納米粒具有良好的生物相容性、生物降解性、高穩(wěn)定性、低宿主免疫反應等特點，可以作為基因載體用于細胞的轉染。殼聚糖(CS)是一種帶高正電荷的天然高分子多糖，可以與帶負電荷的基因、生長因子、 抗腫瘤藥物等結合形成納米粒。透明質酸(HA)是一種天然陰離子多糖，已經被廣泛用于藥物投遞系統(tǒng)的研究。miR-148b是一種強促成骨miRNA，轉染干細胞后可以高效地促進成骨相關基因的表達[4]。本實驗制備CS/HA/miR-148b納米粒并對其理化性質、細胞毒性及轉染效率進行評價，為CS/HA/miR-148b納米粒進一步應用于促進體內骨再生研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

醫(yī)用級殼聚糖(脫乙酰度90%，相對分子質量100 000，金殼，浙江)，透明質酸(相對分子質量10 000，福瑞達，山東)，胎牛血清 (Hyclone，美國)，α-MEM培養(yǎng)液 (低糖型，Gibco，美國)，胰蛋白酶(Sigma，美國)，乙酸(優(yōu)級純，國藥集團)， CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱 (Heraeus，德國)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)。miR-148b (吉瑪, 上海)。

1.2 方法

1.2.1 CS/HA/miR-148b納米粒的制備 參考相關文獻制備CS/HA納米粒[5]。將適量CS溶于2%的乙酸并調整pH值至5.5， 適量HA溶于去離子水中。將CS和HA溶液過慮除菌(0.22 μm)后以1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、 7∶1的體積比混合并在磁力攪拌器上攪拌30 min(3 000 r/min)。HA濃度保持11.25 μg/ml不變，CS的濃度為:5.625、11.25、22.5、33.75、45、56.25、67.5、78.25 μg/ml。 將適量的20 μmol/L miR-148b以不同的N/P(CS的氨基與miRNA的磷酸基團的摩爾比例)加入CS/HA納米粒體系，混勻后室溫下靜置30 min獲得CS/HA/miR-148b。

1.2.2 CS/HA/miR-148b納米粒的性質 通過激光納米粒徑測量儀 (Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, UK) 檢測CS/HA/miR-148b納米粒的粒徑、電位。采用透射電鏡(JEM-1200EX, JEOL Ltd., Japan)觀察納米粒形態(tài)。

1.2.3 凝膠電泳實驗 評價CS/HA納米粒miR-148b包封情況采用2%的瓊脂糖電泳實驗。將裸miR-148b及不同N/P (1∶1、 5∶1、 10∶1、 15∶1、 20∶1、 25∶1) CS/HA/miR-148b納米粒體系加入2%瓊脂糖中，電泳緩沖液為乙酸-EDTA緩沖液(pH 8.0)。在110V電壓電泳20 min后凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照 (GDS-8000, UVP, USA)。

1.2.4 大鼠骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)原代培養(yǎng)及鑒定 參考相關文獻[6]， 頸椎脫臼處死3 周齡SD大鼠后，分離股骨，剪斷兩端后α-MEM沖洗，離心，重懸，原代培養(yǎng)。參考文獻[7]的方法，對第3 代MSCs進行成脂及成骨誘導及鑒定。

1.2.5 CS/HA/miR-148b納米粒細胞毒性檢測

MSCs以2×104/孔接種96 孔板中， 24 h后換液，CS/HA/miR-148b納米粒以25、 50、 100、 200 μg/ml的濃度加入96 孔板中，對照組不含納米粒。在孵箱內培養(yǎng)24 h后采用CCK-8試劑盒(七海生物，上海)進行細胞毒性檢測。

1.2.6 CS/HA/miR-148b納米粒轉染效率檢測 采用流式細胞儀定量檢測不同濃度的CS/HA/miR-148b(miR-148b被Cy3標記)對大鼠MSCs轉染效率。以 5×104/孔的密度將MSCs加入24 孔板， 24 h 后每孔加入含不同濃度的CS/HA/miR-148b納米粒的(0、 50、 100、 150、 200 nmol/L)α-MEM培養(yǎng)液各0.5 ml(不含血清)。轉染 4 h 后更換含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 20 h。然后棄上清，PBS沖洗 2 次，1%多聚甲醛固定 30 min。通過流式細胞儀(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)檢測MSCs中Cy3的熒光強度評價CS/HA/miR-148b轉染的效率。同時將24孔板內的MSCs進行DAPI染色，倒置熒光顯微鏡下定性觀察CS/HA/miR-148b對MSCs的轉染情況。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結 果

2.1 CS/HA/miR-148b納米粒的性質

CS/HA/miR-148b納米粒的粒徑為160～370 nm，電位為+15 mV～+41 mV。CS∶HA為4∶1時納米粒粒徑最小(圖 1)為160 nm，電位為+34 mV。 透射電鏡觀察CS/HA/miR-148b納米粒呈球形分散分布(圖 2)。

2.2 凝膠電泳實驗

如圖 3所示，隨著CS/HA/miR-148b中N/P的比率增加， CS/HA納米粒對miR-148b包封作用越來越明顯，當N/P為20時，可以達到最佳的包封率。

圖 1 CS/HA/miR-148b納米粒的性質

圖 2 透射電鏡觀察CS/HA/miR-148b 納米粒形態(tài)

(A: ×10 000, B: ×40 000)

Fig 2 TEM images of CS/HA/miR-148b nanoparticles

(A: ×10 000, B: ×40 000)

圖 3 凝膠電泳實驗(N/P=1∶1～25∶1)

Fig 3 Gel retardation analysis of HA/CS/miR-148b nanoparticles(N/P=1∶1～25∶1)

2.3 原代培養(yǎng)培養(yǎng)MSCs及多向分化鑒定

原代培養(yǎng)獲得大鼠MSCs，茜素紅染色及油紅染色證明其具有成骨及成脂多向方向分化潛能(圖 4)。

2.4 CS/HA/miR-148b納米粒細胞毒性檢測

如圖 5所示， 25～200 μg/ml CS/HA/miR-148b納米粒對MSCs的增殖均未有明顯抑制作用，說明 CS/HA納米粒是一種安全的基因載體，CS/HA/miR-148b納米粒可以用于進一步細胞轉染實驗。

2.5 CS/HA/miR-148b納米粒轉染效率

如圖 6所示，隨著CS/HA/miR-148b納米粒濃度由50 nmol/L增加至150 nmol/L，其轉染效率逐漸增高。但是，當CS/HA/miR-148b納米粒濃度達到200 nmol/L時，其轉染效率較150 nmol/L沒有明顯增加，說明CS/HA/miR-148b納米粒在150 nmol/L時轉染效率達到了最佳。圖 7顯示在150 nmol/L時，大量紅色的miR-148b(Cy3標記)圍繞在藍色的MSCs核周圍(DAPI染色)。

A: 茜素紅染色； B: 油紅O染色

圖 5 HA/CS/miR-148b納米微粒細胞毒性

*:vs0組,Plt; 0.001; #、 ##和###:vs50 nmol/L組,Plt;0.05、Plt;0.01和Plt;0.001; @:vs100 nmol/L組，Plt;0.05

圖 6 不同濃度HA/CS/miR-148b納米粒轉染效率

*：vs0 group，Plt;0.001; #， ## and ###：vs50 nmol/L，Plt;0.05, 0.01 and 0.001; @：vs100 nmol/L，Plt;0.05

Fig 6 Transfection efficiency of HA/CS/miR-148b nanoparticles with various doses

圖 7 熒光顯微鏡觀察HA/CS/miR-148b納米粒內吞情況/(150 nmol/L)

3 討 論

細胞因子和生長因子等已經被廣泛用于組織再生中，然而，蛋白質類生長因子由于內在穩(wěn)定性差、成本高、半衰期短等缺點限制了其進一步的應用[8]。基因治療提供了一種新的選擇，近年來 miRNA吸引了很多學者的興趣，因為它可以通過調控目標基因的表達廣泛影響細胞功能，包括細胞的增殖、分化、凋亡及其他代謝過程[9]。miRNA在促進干細胞向成骨細胞分化，促進體內成骨方面起到了重要作用。Wu等[10]以脂質體為載體將miR-148b包載后凍干在培養(yǎng)板表面，發(fā)現(xiàn)miR-148b可以成功地轉染入MSCs內并顯著提高堿性磷酸酶、骨鈣素、Ⅰ型膠原等成骨相關基因的表達。

基因轉染技術的關鍵在于安全和較高的轉染效率，轉染載體的選擇尤為重要。病毒和脂質體是最常見的轉染載體，但前者在安全性上存在隱患，后者價格較貴且毒性較大，限制了它們的臨床應用。因此，尋找高效、低毒且價格低廉的載體是基因轉染技術發(fā)展的關鍵。殼聚糖由于其良好的細胞相容性、生物可降解性、無毒性、無免疫原性及抗菌活性等優(yōu)點，在生物醫(yī)學領域倍受關注，殼聚糖作為一種新型的非病毒載體，具有低毒、廉價等優(yōu)點，是近年來基因轉染載體的研究熱點之一[11-12]。

本實驗通過殼聚糖帶正電荷的氨基與透明質酸帶負電荷的羧基間凝聚形成HA /CS納米粒，再吸附帶負電荷的miR-148b從而形成 HA/CS/miR-148b納米粒。CS∶HA為4∶1時納米粒的粒徑為160 nm，電位為+34 mV，有利于細胞的黏附和吞噬，從而順利地將miR-148b轉染入細胞內。Liu等[13]制備了油酰殼聚糖/透明質酸/質粒DNA納米粒并利用此轉染體系對Caco-2細胞系進行轉染，發(fā)現(xiàn)此納米粒轉染體系具有低細胞毒性，高轉染效率的特點。我們制備了HA/CS/miR-148b納米粒并將其用于MSCs的轉染，同樣取得了低毒、高效的轉染效果。

HA /CS納米粒是一個安全、高效的miRNA載體，將HA/CS/miR-148b納米粒用于轉染干細胞并促進骨再生具有廣闊的研究前景。

[1] Li Y, Fan L, Liu S, et al. The promotion of bone regeneration through positive regulation of angiogenic-osteogenic coupling using microRNA-26a[J]. Biomaterials, 2013, 34(21):5048-5058.

[2] Sriram M, Sainitya R, Kalyanaraman V, et al. Biomaterials mediated microRNA delivery for bone tissue engineering[J]. Int J Biol Macromol, 2015, 74:404-412.

[3] Goff LA, Boucher S, Ricupero CL, et al. Differentiating human multipotent mesenchymal stromal cells regulate microRNAs: Prediction of microRNA regulation by PDGF during osteogenesis[J]. Exp Hematol, 2008, 36(10):1354-1369.

[4] Qureshi AT, Monroe WT, Dasa V, et al. miR-148b-nanoparticle conjugates for light mediated osteogenesis of human adipose stromal/stem cells[J]. Biomaterials, 2013, 34(31):7799-7810.

[5] Lu HD, Zhao HQ, Wang K, et al. Novel hyaluronic acid-chitosan nanoparticles as non-viral gene delivery vectors targeting osteoarthritis[J]. Int J Pharm, 2011, 420(2):358-365.

[6] Jia S, Yang X, Song W, et al. Incorporation of osteogenic and angiogenic small interfering RNAs into chitosan sponge for bone tissue engineering[J]. Int J Nanomedicine, 2014, 9:5307-5316.

[7] Gao LN, An Y, Lei M, et al. The effect of the coumarin-like derivative osthole on the osteogenic properties of human periodontal ligament and jaw bone marrow mesenchymal stem cell sheets[J]. Biomaterials, 2013, 34(38):9937-9951.

[8] Peng B, Chen Y, Leong KW. MicroRNA delivery for regenerative medicine[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2015, 88:108-122.

[9] Chen RR, Mooney DJ. Polymeric growth factor delivery strategies for tissue engineering[J]. Pharm Res, 2003, 20(8):1103-1112.

[10]Wu K, Xu J, Liu M, et al. Induction of osteogenic differentiation of stem cells via a lyophilized microRNA reverse transfection formulation on a tissue culture plate[J]. Int J Nanomedicine, 2013, 8:1595-1607.

[11]董培紅, 鄭建建, 盧中秋, 等. 納米殼聚糖攜帶miR-29b轉染肝星狀細胞的實驗研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2013, 23(2):332-337.

[12]陳玉陽, 謝富強, 張赟, 等. 納米殼聚糖骨形成蛋白水凝膠修復下頜骨缺損實驗研究[J]. 實用口腔醫(yī)學雜志, 2014, 30(5):624-628.

[13]Liu Y, Kong M, Cheng XJ, et al. Self-assembled nanoparticles based on amphiphilic chitosan derivative and hyaluronic acid for gene delivery[J]. Carbohydr polym, 2013, 94(1):309-316.

(收稿： 2016-10-22 修回： 2016-11-19)

Preparationandcharacterizationofchitosan/hyaluronicacidnanoparticlesformicroRNA-148bdelivery

WUGuangsheng,HUIGuangyan.

266071,NavyQingdaoFirstSanatorium,China

Objective: To prepare and characterize chitosan/hyaluronic acid (CS/HA) nanoparticles for miRNA-148b(miR-148b) delivery.MethodsCS/HA/miR-148b nanoparticles were prepared. The particle size, zeta potential, morphology were investigated by nano laser granulometer and TEM respectively. The encapsulation efficiency of CS/HA nanoparticles was evaluated by gel retarding analysis. The cytotoxicity and transfection efficiency of CS/HA/miR-148b nanoparticles on rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) were evaluated by CCK-8 assay, transfection assay and FCM respectively.ResultsThe CS/HA/miR-148b nanoparticles were discrete spherical particles with the diameter of 160 to 370 nm and zeta potential of +15 to +41 mV. N/P ratio at 20∶1 of the nanoparticles showed the optimum encapsulation efficiency for miR-148b. CS/HA/miR-148b nanoparticles exhibited no cytotoxicity to MSCs and could deliver miR-148b to the MSCs at high transfection efficiency.ConclusionCS/HA/miR-148b nanoparticles are safe and effective for miR-148b delivery into MSCs.

microRNA;Chitosan;Nanoparticle;Mesenchymalstemcells(MSCs)

青島市市南區(qū)公共領域科技支撐計劃項目(編號： 2014-14-047-SW)

266071， 海軍青島第一療養(yǎng)院

惠光艷 E-mail: huiguangyan1968@126.com

R783.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.007