臨床干血斑樣本中12種抗凝血鼠藥的液相色譜-串聯質譜法同時定量檢測

王怡君，郭 磊，徐 斌，陳 佳，李嘉瑋，邱澤武，謝劍煒*

(1.軍事醫學科學院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850；2.軍事醫學科學院附屬醫院 中毒救治科，北京 100071)

臨床干血斑樣本中12種抗凝血鼠藥的液相色譜-串聯質譜法同時定量檢測

王怡君1，郭 磊1，徐 斌1，陳 佳1，李嘉瑋2，邱澤武2，謝劍煒1*

(1.軍事醫學科學院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850；2.軍事醫學科學院附屬醫院 中毒救治科，北京 100071)

為應對臨床中毒快檢的需求，建立了干血斑樣本中12種抗凝血鼠藥的液相色譜-串聯質譜定性定量方法。針對全打孔的干血斑樣本，考察了濾紙卡種類、潤濕步驟、提取溶劑種類對提取效果的影響。采用C18色譜柱進行分離，以乙酸銨(5 mmol/L)水溶液-乙酸銨(5 mmol/L)甲醇溶液為流動相進行梯度洗脫，在電噴霧負離子電離方式下使用三重四極多反應監測模式檢測。結果表明，采用Whatman903濾紙卡為基底，以水為溶劑充分潤濕，再以含內標的甲醇溶液提取5 min，各鼠藥的提取率為66%～115%，且結果穩定(日內RSD小于15%)。除殺鼠酮的線性范圍為20～500 ng/mL(r2=0.998 7)外，其它11種鼠藥的線性范圍為5～500 ng/mL(r2=0.998 8～0.999 6)；12種鼠藥的回收率為61%～105%，基質效應為71%～193%(日內RSD小于15%)。該方法準確、靈敏、快速且操作簡便，成功應用于3例臨床鼠藥中毒病人樣本的快速檢測，為臨床毒物檢測和法醫毒物分析的快速篩查和準確定量提供了新的技術方法。

干血斑；抗凝血殺鼠藥；液相色譜-串聯質譜法；臨床中毒快檢

因劇毒鼠藥、農藥等有毒化學品的誤服或蓄意投毒造成的臨床化學性中毒事件在我國每年均屢有發生，對民生造成了極大危害。臨床化學性中毒救治亟需快速響應的毒物檢測和臨床診斷方法。臨床干血斑技術的出現，滿足了采樣方便、損傷小、樣本量低、便于運輸及儲存等需要，也便于臨床中毒樣品的監測及快速檢測。干血斑是一種新興的血液采集及保存方式，即將指尖或足尖血滴在濾紙卡上，常溫下干燥2 h以上完成制備[1-2]。其采血量一般少于100 μL；操作簡便，病人或其家屬即可完成采血；蛋白質和酶以非活性方式存在于干血斑中，細菌的生長受到抑制，生物危害性低；不需低溫儲藏，運輸時不需冷藏設備的輔助。目前，干血斑已應用于臨床新生兒疾病篩查、藥物代謝動力學研究及臨床藥物監測[3-4]等方面。例如，Heinig等[5]通過液質方法進行治療藥物的臨床監測，發現干血斑樣品與液態全血、液態血漿的藥物分析數據一致、可靠。但到目前為止，干血斑多在疾病標志物、臨床藥物監測方面展開應用，對臨床毒物監測的研究尚處于起步階段[6-7]。

本文以常見的抗凝血鼠藥化學性中毒為例，對臨床干血斑樣本的抗凝血鼠藥檢測進行方法學和初步應用研究。以香豆素類和茚二酮類為代表的第二代抗凝血殺鼠藥，通過抑制環氧化物還原酶，阻止維生素K還原，降低維生素K依賴性凝血因子活性，導致各臟器及粘膜大面積出血，嚴重者可導致死亡[8]。第二代抗凝血鼠藥具有脂溶性高、毒性強的特點，其半衰期長，在體內清除緩慢，病人治療依從性差，常需長時間連續監測用藥后體內清除進程[9-10]。目前，針對血樣中抗凝血鼠藥的分析檢測方法主要包括液相色譜(LC)[11-12]、氣相色譜-質譜(GC-MS)[13]及液相色譜-串聯質譜技術(LC-MS/MS)[14-17]等。針對全血、組織等生物樣本，需經有機溶劑提取、固相凈化或富集等步驟進行前處理。本文在優化干血斑樣本提取效率的基礎上，建立了普適快速的前處理方法，繼而基于液相色譜-三重四極桿串聯質譜(LC-QqQ-MS/MS)技術，建立了12種常見抗凝血鼠藥臨床干血斑樣本的定性定量檢測方法，并成功應用于3例臨床中毒樣本的快速診斷，方法具有簡便、準確快速、靈敏度高的特點。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 6430型高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀(LC-QqQ-MS/MS，Agilent公司，美國)，配備電噴霧離子源；R200D電子天平(Sartorius，德國)；M-S渦旋混合器(Scilogex公司，美國)；1-14型高速離心機(Sigma公司，美國)；Milli-QA10超純水儀(Millipore公司，美國)；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)和保護柱(4.6 mm，0.2 μm，Agilent公司，美國)；S-4800掃描電鏡(Hitachi公司，日本)。

12種抗凝血鼠藥對照品溶液(10 μg/mL)，包括克滅鼠、華法林、殺鼠酮、殺鼠醚、氯滅鼠靈、敵鼠、氯敵鼠、溴敵隆、溴敵隆酮、鼠得克、氟鼠酮和大隆(純度高于98%，Toronto Research Chemicals公司，加拿大)均由北京疾病預防控制中心配制并提供；霉酚酸(純度高于98%，Ark Pharm公司，美國)；甲醇和乙腈(色譜純，Merck公司，德國)；甲酸(純度98%，百靈威公司，北京)；乙酸銨(純度高于98%，Acros Organics公司，美國)；Milli-Q超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

Whatman DMPK-A、DMPK-B、DMPK-C濾紙卡和903濾紙卡及打孔器(GE公司，美國)。離心管(2.0 mL，Axygen公司，美國)；全血取自Wistar大鼠(許可證號：SCXK(京)2012-0001，飼養于軍事醫學科學院實驗動物中心SPF級動物房)；患者中毒血樣由軍事醫學科學院附屬醫院中毒救治科提供。

1.2 溶液及樣品制備

12種鼠藥混合標準儲備溶液：質量濃度為10 μg/mL，溶于甲醇，于-20 ℃保存。

12種鼠藥混合標準工作溶液：取適量標準儲備溶液，以甲醇逐級稀釋至質量濃度為1 000、100 ng/mL，于4 ℃保存(需在1個月內使用完畢)。

質量控制(QC)溶液質量濃度分別為5、20、50、100、200、500 ng/mL。

內標儲備溶液：稱取2 mg霉酚酸，以甲醇配制成1 mg/mL溶液，于-20 ℃保存。

內標工作溶液：取適量內標儲備溶液，以甲醇稀釋至200 ng/mL，于4 ℃冰箱中保存(需在1個月內使用完畢)。

干血斑樣本的制備：吸取20 μL全血滴在濾紙卡上(直徑約1 cm)，室溫下干燥2 h即得。

1.3 樣品前處理

選取整個干血斑，用打孔器取下，置于離心管中，加入20 μL水，待潤濕后，加入80 μL內標溶液，渦旋5 min，移取全部溶液，以12 000 r/min離心5 min，吸取上層清液至進樣瓶。

1.4 色譜條件

固定相：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；保護柱(4.6 mm，0.2 μm)；流動相：A為5 mmol/L 乙酸銨水溶液，B為5 mmol/L 乙酸銨的甲醇溶液；流速：0.2 mL/min；梯度洗脫程序：0～1.5 min，30%～80%B；1.5～6.0 min，80%～95%B；柱溫：50 ℃；進樣體積：5 μL。

1.5 質譜條件

離子源：電噴霧電離源(ESI源)；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應監測(MRM)；噴霧壓力40.0 psi，離子源溫度100 ℃，霧化器溫度：325 ℃；霧化器流量：10.0 L/min；毛細管電壓：3.5 kV。

2 結果與討論

所考察的12種抗凝血殺鼠藥可分為香豆素類和茚二酮類兩種，其油水分布系數(logD)介于1.6～9.3之間，即極性分布范圍較寬，與濾紙卡間形成的作用力可能存在多種形式。按母核結構及logD值排序，將12 種鼠藥分成4組：A組為殺鼠酮、敵鼠和氯敵鼠(茚二酮類，logD值1.6～5.3)，B組為克滅鼠、華法林和氯滅鼠靈(香豆素類，logD值2.6～4.0)，C組為殺鼠醚、溴敵隆和溴敵隆酮(logD值5.0～8.3)，D組為鼠得克、氟鼠酮和大隆(logD值8.4～9.3)，進行干血斑處理及提取條件等因素的考察。

2.1 濾紙卡類型

濾紙卡由于其自身材質和修飾方式的不同，與基質及待測化合物可能呈現出不同的相互作用，從而影響待測化合物的提取效率。對于20 μL全血，選用Whatman型濾紙卡(厚度0.50～0.74 mm)，較之普通化學定量濾紙(厚度0.18 mm)更利于血液的集中分布，其擴散半徑僅為0.5 cm。實驗比較了903型、DMPK-A、-B、-C型4種類型的濾紙卡，其中903型和DMPK-C型未經任何化學修飾，DMPK-A型以自由基抑制劑、DMPK-B型以離液等成分進行修飾，均可起到變性蛋白、裂解細胞等作用[18]。各類型濾紙卡在滴加血液后的形態如圖1所示。與其它3種濾紙卡相比，僅DMPK-A型卡上的干血斑出現明顯的“咖啡環”效應，DMPK -B型卡上的干血斑呈現中央聚集，提示其上存在一定修飾。DMPK -C型卡和903卡上的血滴分布相對較為均勻。在掃描電鏡下，DMPK-B型卡上纖維素表面更加粗糙。

針對12種抗凝血鼠藥，以甲醇進行提取的結果表明，使用DMPK-A卡，未能檢測到溴敵隆和溴敵隆酮，其它10種鼠藥的絕對回收率在30%～98%之間。使用DMPK-B、DMPK-C卡、903卡，均可檢測到12種鼠藥，絕對回收率分別為10%～59%、43%～106%、65%～115%。4種類型的濾紙卡中，茚二酮類鼠藥在DMPK-A、DMPK-C卡上得到了相對較高的回收率(60%～90%)；而9種香豆素類抗凝血鼠藥在903卡上的回收率最高(65%～115%)。大部分化合物在DMPK-C和 903卡上響應接近，考慮到903卡已獲得FDA認證，且在臨床上應用較為廣泛，因此選用903濾紙卡進行后續研究。每組鼠藥在相同濾紙卡上的響應差別小于10%，說明數據重復性較好，分組亦較為合適。

圖1 光學顯微鏡(上)及掃描電鏡(下)下的干血斑在各濾紙卡上的形態Fig.1 The pattern of dried blood spots on different kinds of filter paper cards under microscope(upper) and scanning electron microscope (lower)A：DMPK-A card,B：DMPK-B card,C：DMPK-C card,D：903 card

2.2 樣品前處理步驟的優化

在干血斑中，濾紙不僅作為血液樣本的承載基底，更能利用纖維素自身膨脹和吸附的特性與目標物質發生作用。當血液滲透濾紙時，經氫鍵作用，纖維素鏈間結合了大量水分子，其結構發生膨脹。同時，纖維素鏈相互交錯形成空隙，小分子物質可進一步結合到纖維素鏈間，大分子物質則留于空隙中或置于空隙外。當水分丟失后，纖維素結構趨向恢復自然狀態，各種物質分布于濾紙的表面或較深處[19]。因此若先加入適量水使濾紙膨脹后，有可能利于小分子物質從纖維素鏈間游離出來，從而提高提取效率，繼而可再加入有機溶劑進行提取。結果表明，與直接用有機溶劑提取相比，先以水潤濕再以有機溶劑提取的回收率提高了8%～30%。

圖2 4種溶劑的提取效果對比圖Fig.2 The extraction efficiency by four kinds of solvents

提取溶劑種類方面，比較了甲醇、含0.5%甲酸的甲醇、乙腈及甲醇-乙腈(1∶4)的提取效果(圖2)，發現純甲醇、乙腈提取時各鼠藥的提取率較高(60%～115%)，說明濾紙卡上抗凝血鼠藥在提取溶劑中的分配與極性直接相關。因此本實驗采用甲醇作為提取溶劑。

2.3 液相色譜條件優化

使用乙酸銨水溶液(A)-乙酸銨甲醇溶液(B)為流動相進行梯度洗脫，各化合物在B相為80%～95%的梯度洗脫范圍內流出，各峰的保留時間與logD基本呈正相關?？疾炝薈APCELL CORE C18(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)柱(Ⅰ)、Syncronis C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)柱(Ⅱ)和ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)柱(Ⅲ)的分離情況，結果顯示，采用色譜柱Ⅰ時，華法林、殺鼠醚等峰形不佳，出現肩峰；采用色譜柱Ⅱ時，各化合物的峰形較好，但分離時間較長(達到14 min)；采用色譜柱Ⅲ時，各化合物的峰形對稱、分離好、洗脫時間短，故選用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱。12種鼠藥的MRM參數見表1，MRM色譜圖見圖3。

表1 12種抗凝血鼠藥及內標的結構式、logD值及MRM參數Table 1 The structures,logD values and MRM parameters of 12 anticoagulant rodenticides

(續表1)

CompoundType—RgrouplogDIonpair?Fragmentor/VCollisionenergy/eVChlorophacinone(氯敵鼠)5 3373→201?373→1451301822Mycophenolicacid(霉酚酸)IS2 8319→191?319→2501201822

*quantitative ion pair

圖3 12種抗凝血鼠藥的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of 12 anticoagulant rodenticides peaks：1.coumafuryl；2.warfarin；3.pindone；4.coumatetralyl； 5.coumachlor；6.diphacinone；7.chlorophacinone； 8.bromadiolone；9.bromadiolonone；10.difenacoum； 11.flocoumafen；12.brodifacoum；IS：mycophenolic acid

2.4 方法學驗證

2.4.1定量下限與標準曲線針對所制備的干血斑樣品，以10倍信噪比(S/N=10)所對應的濃度作為定量下限(LOQ)。以化合物與內標的定量離子對峰面積比值(Y)為縱坐標，干血斑中化合物的質量濃度(X，ng/mL)為橫坐標，以1/X加權擬合標準曲線。除殺鼠酮的線性范圍為20～500 ng/mL(r2=0.998 7)外，其余11種鼠藥的線性范圍均為5～500 ng/mL(r2=0.998 8～0.999 6)，滿足方法學要求，結果見表2。

表2 12種鼠藥的定量下限和線性范圍Table 2 The LOQ and linear range of 12 anticoagulant rodenticides

2.4.2準確度與精密度對定量下限、低、中、高4個濃度進行考察，其中低濃度點為2倍定量下限，中濃度選取線性范圍的中間濃度，高濃度點為80%定量上限。每個濃度獨立制備5份干血斑樣品，共測定3批樣品，按照前處理方法操作，其精密度和準確度結果見表3。結果顯示，各鼠藥的批內和批間精密度、準確度均滿足方法學要求。

2.4.3回收率與基質效應全血等復雜基質組分一般會通過影響被測物的離子化效率而影響待測物的響應，因此考察了基質效應。于低、高2個濃度分別制備3份樣品，結果顯示，該方法存在一定的基質增強作用，但其精密度尚能滿足方法要求(RSD均小于15%，表3)。

表3 干血斑中12種抗凝血殺鼠藥的批內和批間準確度、精密度、回收率和基質效應Table 3 Inter- and intra-batch accuracy and precision,recovery and matrix effect of 12 anticoagulant rodenticides in dried blood spots

圖4 患者干血斑樣本中檢測的抗凝血鼠藥的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of anticoagulant rodenticides detected in the dried blood spotscoming from a clinical patient

2.5 應 用

本研究收集并制備了3位疑似抗凝血鼠藥中毒患者的干血斑樣本?；颊咴谒歪t時，分別出現牙齦出血、尿血、鼻出血、尿色深等癥狀。經詢問，各患者口述均未接觸抗凝血鼠藥或藥物，初步推測為誤食或者投毒所致。采用上述建立的方法，在1名未經維生素K治療的患者血液中檢出溴敵隆，質量濃度為(1.62±0.02) μg/mL，未檢出其它鼠藥，其MRM色譜圖見圖4。在另兩位經服用維生素K治療患者血液中檢出溴敵隆，質量濃度為(0.13±0.01) μg/mL和(0.66±0.02)μg/mL，與其它報道的中毒濃度相當[9,20-21]。

3 結 論

本研究針對臨床干血斑樣本，建立了以水潤濕、甲醇提取等普適的前處理方法，以霉酚酸作為內標，采用液相色譜-三重四極桿串聯質譜實現了對12種香豆素類和茚二酮類抗凝血殺鼠藥的定性定量分析。結果表明，在提取過程中加入適量的水潤濕濾紙卡，有助于目標化合物從纖維素鏈上游離出來并獲得較高的提取回收率。DMPK-A、DMPK-B、DMPK-C和903等4種濾紙卡對于抗凝血鼠藥的干血斑分析存在差異，以903濾紙卡為基底時，各鼠藥提取率均較高且結果穩定。該方法成功應用于臨床實際中毒樣本的檢測，滿足臨床中毒快檢的需求，為抗凝血鼠藥中毒的診斷救治提供了可靠的新技術方法。

[1] Wanger M,Tonoli D,Varesio E,Hopfgartner G.MassSpectrom.Rev.,2014,35(3):361-438.

[2] Sharma A,Jaiswal S,Shukla M,Lal J.DrugTestingAnal.,2014,6(5):399-414.

[3] Shokry E,Villanelli F,Malvagia S,Rosati A,Forni G,Funghini S,Ombrone D,Bona M D,Guerrini R,La Marca G.J.Pharm.Biomed.Anal.,2015,109(1):164-170.

[4] Zikanova M,Krijt J,Skopova V,Krijt M,Baresova V,Kmoch S.Clin.Biochem.,2014,48(1/2):2-7.

[5] Heinig K,Bucheli F,Hartenbach R,Gajate-Perez A.Bioanalysis,2010,2(8):1423-1435.

[6] John H,Willoh S,H?rmann P,Siegert M,Vondran A,Thiermann H.Anal.Chem.,2016,88(17):8787-8894.

[7] Perez J W,Pantazides B G,Watson C M,Thomas J D,Blake T A,Johnson R C.Anal.Chem.,2015,87(11):5723-5729.

[8] King N,Tran M H.TransfusionMed.Rev.,2015,29(4):250-258.

[9] Yan H.FudanUniv.J.：Med.Sci.(嚴慧.復旦大學學報：醫學版),2011,38(4):361-366.

[10] Imran M,Shafi H,Wattoo S A,Chaudhary M T,Usman H F.ForensicSci.Int.,2015,253:94-102.

[11] Palazoglu M G,Tor E R,Holstege D M,Galey F D.J.Agric.FoodChem.,1998,46(10):4260-4266.

[12] Guan F Y,Ishii A,Seno H,Watanabe K,Kumazawa T,Suzuki O.J.Pharm.Biomed.Anal.,1999,21(1):179-185.

[13] Maurer H H,Arlt J W.J.Chromatogr.B,1998,714(2):181-195.

[14] Jin M C,Ren Y P,Xu X M,Chen X H.ForensicSci.Int.,2007,171(1):52-56.

[15] Vandenbroucke V,Desmet N,De Backer P,Croubels S.J.Chromatogr.B,2008,869(1/2):101-110.

[16] Fourel I,Hugnet C,Goy-Thollot I,Berny P.J.Anal.Toxicol.,2010,34(2):95-103.

[18] Luckwell J,Denniff P,Capper S,Michael P,Spooner N,Mallender P,Johnson B,Clegg S,Green M,Ahmad S,Woodford L.Bioanalysis,2013,5(21):2613-2630.

[19] Henion J,Oliveira R V,Chace D H.Bioanalysis,2013,5(20):2547-2565.

[20] Vindenes V,Karinen R,Hasvold I,Bernard J P,M?rland J G,Christophersen A S.J.ForensicSci.,2008,53(4):993-996.

[21] Bidny S,Gago K,David M,Duong T,Albertyn D,Gunja N.J.Anal.Toxicol.,2015,39(3):219-224.

Simultaneous Determination of Twelve Anticoagulant Rodenticides in Clinical Dried Blood Spots by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Yi-jun1,GUO Lei1,XU Bin1,CHEN Jia1,LI Jia-wei2，QIU Ze-wu2,XIE Jian-wei1*

(1.State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures,Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China；2.Department of Poisoning and Treatment,The Affiliated Hospital of Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071,China)

To address the fast detection need towards poisoned patients in clinic,a sensitive,accurate liquid chromatographic-tandem mass spectrometric method was developed here for the qualitative and quantitative determinations of twelve anticoagulant rodenticides in dried blood spots.For the thoroughly punched dried blood spots,conditions influencing the extraction efficiency,including the kind of filter paper card,the water-soaking step and the kind of extraction solvent were investigated.A C18column was employed as separation phase while ammonium acetate in water (5 mmol/L)-ammonium acetate in methanol(5 mmol/L) was used as mobile phase by gradient elution.Then the sample was detected using negative electrospray ionization under multiple reaction monitoring mode.The results showed that,with the 903 type filter card as supporting matrix and a water-soaking step,followed by an extraction with methanol solvent containing internal standard for 5 min,the extraction efficiencies of the twelve rodenticides ranged from 66%to 115%with their intra-day relative standard deviations less than 15%.Good method validation results were obtained for all the anticoagulant rodenticides.The linearity for pindone was from 20 to 500 ng/mL with a correlation coefficient(r2) of 0.998 7,and that for the other eleven analytes were from 5 to 500 ng/mL with theirr2of 0.998 8-0.999 6.The recoveries for all the analytes ranged from 61%to 105%,with the matrix effects of 71%-193%and the intra-day relative standard deviations less than 15%.The established method was accurate,sensitive,rapid and convenient,and was successfully applied in the rapid detection of rodenticides in three clinic blood samples.It provides a new approach for clinical diagnosis and forensic toxicant analysis on anticoagulant rodenticide intoxication accidents.

dried blood spot；anticoagulant rodenticide；liquid chromatography-tandem mass spectrometry；fast detection on poisoned clinical samples

2017-06-20；

2017-07-20

全軍醫學科技“十三五”重大項目(AWS15J007))

*

謝劍煒，博士，研究員，研究方向：體內外毒物分析、質譜分析，Tel:010-66931649，E-mail:xiejw@bmi.ac.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.11.002

O657.7；O657.63

A

1004-4957(2017)11-1296-08