骨髓間充質干細胞復合脫細胞軟骨和富血小板血漿的體內成骨實驗

馮曉珂 董巖 李治冶 吳煒 趙銥民

骨髓間充質干細胞復合脫細胞軟骨和富血小板血漿的體內成骨實驗

馮曉珂 董巖 李治冶 吳煒 趙銥民

目的研究骨髓間充質干細胞(BMSCs)和富血小板血漿(PRP)復合物中加入脫細胞軟骨碎塊(DCM)后的成骨能力。方法全骨髓貼壁法分離培養兔BMSCs；采集兔新鮮動脈血制備PRP；剪取新鮮兔耳碎化后用化學法脫細胞制備DCM，將BMSCs與PRP和DCM混合后注射到裸鼠皮下，8 周后取材觀察成骨情況。結果體外實驗顯示本實驗分離培養的BMSCs有較強的成骨、成脂分化能力，軟骨碎塊脫細胞效果理想，8 周裸鼠體內結果取材蘇木精-伊紅染色(HE)和改良Massons染色顯示類骨質和骨質較多，甲苯胺藍(TB)染色顯示剩余軟骨成分較少。結論BMSCs-PRP-DCM復合物誘導軟骨內成骨。

骨髓間充質干細胞(BMSCs)； 富血小板血漿(PRP)； 脫細胞軟骨碎塊(DCM)； 軟骨內成骨

現有組織工程骨的支架材料主要是人工合成的骨替代品如羥基磷灰石等，而這類支架材料在體內移植手術中都要開放的手術，無法微創。此外這些支架材料本身無活性，很難完全融合于自體骨。由于支架材料的存在，限制了細胞的移動和相互間作用，不能快速的血管化和骨化，阻礙了骨或軟骨再生[1]。Ma等[2]利用骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)在裸鼠體內成功構建了可注射的組織工程骨。但是，注射物中僅含有干細胞及其分泌的細胞外基質等，而不含有效的生長因子。富含自體細胞因子和生長因子的富血小板血漿(platelet rich plasma, PRP)，作為一種新型的生物材料已經被應用于臨床中[3]。PRP可以促進骨形成，尤其是加快移植骨愈合速度，其制備方法簡單，便于微創操作。脫細胞軟骨碎塊(decellularized cartilage matrix, DCM)脫細胞去除了免疫原性，剩余基質可以提供一個三維空間，同時模擬軟骨內成骨時的軟骨導板，并逐漸被骨組織替代[4]，同時碎化了的DCM也可以被注射。本實驗通過BMSCs-PRP-DCM復合物注射到裸鼠體內后，觀察其異位成骨情況，來探討注射成骨方法的可行性和PRP 能不能提高BMSCs的成骨能力。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

DMEM高糖培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、抗壞血酸、核酸酶(Sigma，美國)； 枸椽酸鈉(分析純, 汕頭光華化學廠)；雙抗(Amresco，美國)；1%十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)，1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，乙醚，4%多聚甲醛國定液，Thermo Forma CO2細胞培養箱( Thermo,Scientifi,美國)；體視顯微鏡(Nikon, 日本)；顯微鏡電腦分析系統(Nikon CX J30, 日本)，酶標儀(Beckman，美國)。

1.2 BMSCs細胞的獲取及誘導分化

BMSCs的獲取：1 月齡新西蘭白兔，陸眠寧麻藥注射處死，取股骨及脛骨髁部，全骨髓法培養BMSCs。取第2代BMSCs用于后續實驗，倒置顯微鏡下拍照。

成骨誘導：取第3代BMSCs，當細胞生長融合約90%后，培養液換為成骨誘導培養液(15%FBS，1%雙抗，50 μg/ml 左旋抗壞血酸，10-7mol/L 地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)進行成骨誘導培養。3 周后茜素紅染色，光鏡觀察，拍照。

成脂誘導：取第3代BMSCs，當細胞生長融合約90%后，成脂誘導培養液[15%FBS，1%雙抗，0.5 mmol/L 異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)，10 μmol/L 胰島素(0.01 mg/ml)，1 μmol/L 地塞米松，200 μmol/L 吲哚美辛]誘導培養3 d；成脂誘導維持液(15%FBS，1%雙抗，0.01 mg/ml 胰島素)維持培養2 d。油紅O染色，鏡下觀察，拍照。

1.3 PRP的制備

3 月齡新西蘭白兔，陸眠寧麻醉后，取兔耳緣靜脈血，按照9∶1的體積比加入3.8%的枸櫞酸鈉抗凝液。兩步離心法制備PRP： 2 300 r/min，8 min離心，分3 層，取上2 層3 300 r/min，8 min離心。

1.4 DCM的制備及檢測

3 月齡新西蘭大白兔，耳緣靜脈注射空氣處死，剪取雙耳，取耳軟骨于液氮中浸泡5 min，組織研磨儀粉碎，收集碎化的兔耳軟骨，加入1%SDS液脫細胞24 h，1%Triton X-100繼續破膜4 h，加入核酸酶處理30 min，大量PBS沖洗，凍干24 h后環氧乙烷滅菌待用。

1.4.1 體視顯微鏡觀察 體視顯微鏡下觀察脫細胞后的軟骨碎塊尺寸。

1.4.2 組織學染色觀察 DCM用4%多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋切片，分別進行HE和TB染色。

1.4.3 DCM細胞毒性檢測 DCM制備的浸提液與實驗所用細胞同來源的BMSCs共培養作為實驗組，同前的常規培養液與實驗組同來源的BMSCs共培養作為對照組來檢測脫細胞軟骨的毒性。

1.5 體內成骨實驗

1.5.1 復合物的構建 實驗組：2.25×107個BMSCs,500 μl PRP，500 μl脫細胞軟骨碎塊混合成復合物，加入50 μl凝血酶(100 U/ml ，富含100 mg/ml氯化鈣)，搖勻， 40 s后，復合體凝結成凝膠樣。

對照組：500 μl PRP，500 μl脫細胞軟骨碎塊混合成復合物，加入50 μl凝血酶(100 U/ml ，富含100 mg/ml氯化鈣)，搖勻， 40 s后，復合體凝結成凝膠樣。

1.5.2 裸鼠皮下實驗 6 周齡雄性裸鼠，隨機分2 組。乙醚麻醉后，用2 ml注射器加16 G針頭分別注射至裸鼠背部皮下，無菌環境中喂養8 周，處死，取材。樣本在4%多聚甲醛中固定48 h，EDTA脫鈣2 周，用石蠟進行包埋，切片，HE、改良Massons和TB染色。

1.6 統計學分析

所有數據用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。組間比較采student-t檢驗。Plt;0.05具有統計學意義。

2 結 果

2.1 BMSCs形態學觀察

原代的BMSCs呈集落樣生長，細胞呈長梭形。成骨誘導染色后，可見鈣化結節形成，成脂誘導染色后，可見脂滴形成(圖 1)。

2.2 DCM形態觀察及細胞毒性檢測

體視顯微鏡下的軟骨碎塊經過脫細胞的處理后呈透亮狀，直徑約200 μm。HE染色顯示細胞基本被除去，剩余組織呈多孔狀TB染色顯示，脫細胞后，軟骨仍然保留了絕大部分的基質成分。細胞毒性檢測顯示脫細胞軟骨浸提液和正常培養液對細胞增殖影響無統計學差異(Pgt;0.05)(圖 2)。

2.3 體內成骨實驗

實驗組8 周HE染色可見致密的間質以及高度礦化的組織，可見較多類骨質，形成較多血管，并有明顯的血管長入脫細胞軟骨中(圖 3A)。改良Massons染色中則更加明顯的顯示了成骨膠原的增多，同時原有的軟骨膠原在逐漸減少(圖 3B)。TB染色中則顯示淡紫色的肥大化細胞增多(圖 3C)。

對照組8 周的HE染色則顯示了明顯較少的間質和血管，原脫細胞軟骨碎塊并未在間質的包饒連接下緊密連接，礦化組織和類骨質更少(圖 3D)，同時改良Massons染色顯示對照組的脫細胞軟骨碎塊的基質中仍剩余較多的軟骨膠原成分(圖 3E)。TB染色中仍然可以看到較多的藍染的軟骨成分(圖 3F)。

圖 1 BMSCs 形態及鑒定(A: ×20, B～C: ×10)

Fig 1 Characterization of BMSCs(A: ×20, B-C: ×10)

圖 2 脫細胞軟骨碎塊的形態及毒性檢測(A～C: ×20)

Fig 2 Characterization and cytotoxicity of decellularized cartilage fragments(A-C: ×20)

圖 3 細胞-PRP-脫細胞軟骨碎塊復合物及對照組組織學染色

3 討 論

現有研究多采用羥基磷灰石，磷酸三鈣，聚醚醚酮等人工合成生物材料復合BMSCs實現骨再生[5]。人工合成生物材料因為其生物惰性而難以降解進而不能很好的和移植宿主自體骨相融合。

因此發展一種碎化的，免疫排斥反應小的又可以實現微創的骨替代材料被寄予厚望。脫細胞軟骨首先進入人們視野是被用于成軟骨的組織工程中，因脫細胞而沒有了免疫原性使其應用范圍擴大。Debby等[6]利用脫細胞軟骨復合BMSCs成功構建了組織工程骨，其中脫細胞軟骨充當了軟骨導板的作用，模擬了胚胎時期成骨方式之一——軟骨內成骨[7]。而碎化的脫細胞軟骨相當于很多個微小的軟骨導板，不僅提供了三維立體的附著空間，更有利于血管的長入。PRP是利用自身的血液提取出富含高濃度血小板和各種自身生長因子的血漿，較易獲取且沒有免疫原性，在凝血酶的作用下可成為凝膠狀物質[8]，從而使整個BMSCs-PRP-DCM復合物成為可注射性的凝膠狀，保證了注射后復合物可以維持一定的形態。DCM同時復合BMSCs和PRP，延長了BMSCs壽命，促進了復合物成骨和成血管[9]。

本實驗中動物體內實驗的結果顯示，在有了DCM的支撐下，BMSCs更好的存活下來并經歷肥大化和礦化最終向成骨分化。DCM保留了原有軟骨基質中的成分，這使得DCM不僅具有了多孔狀的三維立體結構，更賦予了其一定的機械強度來支撐整個復合體。血管不僅出現在間質，更長入了DCM中間，這也是軟骨肥大化的直接證據[10]，說明PRP的參與促進了復合物的血管化。植入的DCM經歷8 周的體內轉化，由軟骨向骨轉化逐漸被替代，骨性膠原明顯多于軟骨性膠原[11]，同時塊與塊之間相互融合，形成一個整體。BMSCs-PRP-DCM復合物實現了很好的血管化和骨化[12]。而對照組因缺乏BMSCs出現了嚴重的吸收，并且沒有明顯的成骨證據，這也證明了BMSCs在成骨過程中的重要作用。

為進一步驗證BMSCs-PRP-DCM復合物的成骨能力，我們計劃在未來實驗中進行極限骨缺損修復的體內研究、成骨機制的探討、骨細胞來源探討等。

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(收稿： 2016-10-19 修回： 2016-11-17)

Boneregenerationwithbonemarrowmesenchymalstemcells,plateletrichplasmaanddecellularizedcartilagematricescomplex

FENGXiaoke,DONGYan,LIZhiye,WUWei,ZHAOYimin.

710032Xi'an,StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatologyamp;NationalClinicalResearchCenterforOralDiseasesamp;ShaanxiKeyLaboratoryofOralDiseases,DepartmentofProsthodontics,SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,China

Objective: To study the bone regeneration capacity of the complex of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) and platelet rich plasma(PRP) with decellularized cartilage matrix(DCM).MethodsBMSCs were isolated from young rabbit and cultured; PRP were prepared from the fresh blood of rabbit and the DCM were come from the fresh ears of rabbits and processed into a mixture of BMSCs-PRP-DCM. The mixture was injected subcutaneously into nude mice, 8 weeks after injection bone regeneration was examine by HE staining and Massons staining decellularization.ResultsThe BMSCs show good differentiation capacityinvitroand the cartilage fragments were well decellularized. Excellent endochondral ossification ability of the complex was observed byinvivoexperiment.ConclusionThe BMSCs-PRP-DCM complex has good capacity of endochondral ossification.

Bonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs);Plateletrichplasma(PRP);Decellularizedcartilagematrix(DCM);Endochondralossification

國家自然科學基金(編號： 81271104)； 陜西省自然科學基礎研究計劃(編號： 2016JM8086)

710032 西安，軍事口腔醫學國家重點實驗室，口腔疾病國家臨床醫學研究中心，陜西省口腔疾病重點實驗室，第四軍醫大學口腔醫院修復科

趙銥民 029-84779195 E-mail: zhaoym@fmmu.edu.cn

R318.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.002