口腔疣狀癌中LRIG1的表達及其抑癌作用的初步研究

鄧智元 唐瞻貴 王月紅 李毅萍

臨床醫(yī)學研究

口腔疣狀癌中LRIG1的表達及其抑癌作用的初步研究

鄧智元 唐瞻貴 王月紅 李毅萍

目的探討富含亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白樣多肽 1(LRIG1)在口腔疣狀癌中的表達及其抑癌作用的機制。方法收集口腔疣狀癌(n=15)、口腔鱗狀細胞癌(n=30)及對應(yīng)癌旁組織石蠟標本共90 例，以15 例外傷患者的正常黏膜組織作為對照；免疫組織化學染色技術(shù)(SP法)檢測其中LRIG1和Bcl-2的表達，并用皮爾森分析二者相關(guān)性。結(jié)果LRIG1在正常黏膜、口腔疣狀癌、口腔鱗狀細胞癌組織中的表達依次下降(Plt;0.05)并伴隨Bcl-2的表達依次升高(Plt;0.05) ；并且，LRIG1與Bcl-2表達呈負相關(guān)。結(jié)論LRIG1可能通過抑制Bcl-2的表達抑制口腔疣狀癌的發(fā)生發(fā)展。

口腔疣狀癌； LRIG1； Bcl-2； 凋亡

1948 年口腔疣狀癌(oral verrucous carcinoma,OVC)作為一種低度惡性且生物學行為不具備轉(zhuǎn)移性的口腔黏膜鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)亞型首次被提出并獲得越來越多的關(guān)注和研究[1-2]。既往的經(jīng)驗表明唇部和頰部是疣狀癌的高發(fā)部位，除此之外也見于舌、口底、咽喉、食道、鼻腔、鼻旁竇、外生殖器器和皮膚等[3]。目前OVC的治療方法主要有手術(shù)、化療、放療或者聯(lián)合治療，雖然預(yù)后良好，但復(fù)發(fā)率較高[4]。60 歲左右的吸煙男性是其高發(fā)群體，其致病機理主要與咀嚼煙草、檳榔和感染人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)有關(guān)，且VEGF、E-cadherin和MDM2等基因在OVC的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[5-8]。盡管很多學者致力于OVC的研究，但是其具體發(fā)病機制尚未完全清楚。

富含亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白樣多肽-1(leuncine- rich repeats and immunoglobulin- like domains protein 1, LRIG1)基因為一種細胞表面跨膜糖蛋白，廣泛存在于人體的各組織中[9-10]。它在多種腫瘤細胞中異常表達，在多種因素的影響下具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[11-13]。甚至，可能通過增強受體泛素化和加速細胞內(nèi)降解負反饋調(diào)節(jié)受體酪氨酸激酶的多條信號通路，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，促進腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞生長[14-15]。本研究運用免疫組化法檢測LRIG1在OVC中的表達，并對其促凋亡作用進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集1996～2014 年間于中南大學湘雅醫(yī)院口腔病理科確診并保存完好的正常口腔黏膜(normal mucosal tissue，NM)、口腔疣狀癌(OVC)和口腔鱗癌(OSCC)石蠟標本及臨床資料共90 例，其中OVC及其癌旁組織各15 例、OSCC 及癌旁組織各30 例。OSCC組織標本均為高分化鱗癌組織,來源于男性患者26 例，女性4 例，其平均年齡(57±9.3) 歲，且均為原發(fā)于口腔的初診癌癥患者。OVC組中，男性11 例，女性4 例，平均年齡(54±11.3) 歲，也均為原發(fā)于口腔的初診病例。另外，經(jīng)由患者及其家屬同意，采集15 例頜面部外傷患者的口腔黏膜標本固定、包埋，作為對照，其中，男性6 例，女性9 例，平均年齡(35±13.3) 歲。

1.2 試劑耗材

鼠抗人Bcl-2單克隆抗體 (cell signaling technology, USA);兔抗人LRIG1多克隆抗體 (Abcam, UK);山羊血清、SP法免疫組化試劑盒(包括3%過氧化氫水，生物素標記IgG二抗和抗生物素-親和素-過氧化物酶試劑、PBS緩沖液、DAB顯色試劑(OriGene Technologies, Inc., USA)。

1.3 免疫組化染色

切片厚度每張約4 μm，置于60 ℃恒溫箱2.5 h，然后按照常規(guī)脫蠟、水化；在0.01 mol/L檸檬酸緩沖溶液(pH值6.0)高壓水浴煮90 s； 3%過氧化氫37 ℃恒溫20 min去除內(nèi)源性過氧化物酶；10%正常山羊血清37 ℃恒溫1 h封閉非特異性抗原；一抗4 ℃孵育過夜；生物素標記IgG二抗和抗生物素-親和素-過氧化物酶試劑孵育切片；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；陰性對照以PBS緩沖液沖洗代替一抗。

1.4 染色結(jié)果判定

每張切片用Aperio ScanScope CS 掃描(Leica Microsystems, Inc., Buffalo Grove, IL, USA)，減少背景影響；運用配套的Aperio Quantification software version 9.1軟件量化核、膜或總表達水平[16]。選擇性量化上皮細胞和癌變區(qū)域。核和膜染色的表達分數(shù)(3+ 、2+、 1+，分別表示強、中、弱陽性染色)按陽性細胞的百分比使用以下公式計算: (3+)×3+(2+)×2+(1+)×1。總量化的表達分數(shù)被列為總強度或總細胞數(shù)[17]。Aperio通過掃描陽性細胞設(shè)置閾值提供的對照標準[17-19]。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 LRIG1的表達

LRIG1在OVC組織中表達降低。LRIG1主要表達在各組織的細胞膜和細胞質(zhì)中；通過量化免疫組化染色強度，我們發(fā)現(xiàn)LRIG1在NM中表達顯著高于OVC和OSCC(圖 1)。此外，LRIG1在OVC和OSCC中表達水平較癌旁組織顯著降低；而且LRIG1在OVC中表達低于NM，但高于OSCC組織。

2.2 Bcl-2的表達

Bcl-2在OVC組織中表達升高。Bcl-2主要表達于OVC和OSCC的細胞質(zhì)中，而在正常口腔黏膜中表達缺失；Bcl-2在NM中表達相對于OVC和OSCC顯著減少；此外，Bcl-2在OVC和OSCC中表達水平顯著高于癌旁組織(圖 2)。

2.3 LRIG1與Bcl-2的相關(guān)性

在NM、 OVC和OSCC中LRIG1與Bcl-2的表達呈顯著負相關(guān)。

3 討 論

口腔疣狀癌作為一種惡性程度低于口腔鱗狀細胞癌的特殊亞型，“推進緣”是其病理學特征。本研究中LRIG1在口腔疣狀癌和口腔鱗癌中均低表達，這與國內(nèi)外文獻報道LRIG1在許多腫瘤細胞中表達降低, 如膠質(zhì)瘤、肺癌、直腸癌等相吻合[11-13]。且LRIG1在OVC中的表達高于OSCC，說明LRIG1的下降水平與腫瘤的惡性程度具有相關(guān)性。閆堯等[20]應(yīng)用RT-PCR的方法分析了36 例食管鱗狀細胞癌患者的癌組織、癌旁組織和遠癌組織中LRIG1mRNA的表達情況，結(jié)果顯示36 例癌組織中有15 例陽性表達，21 例LRIG1表達缺失，其陽性表達率低于相應(yīng)的癌旁組織和遠癌組織。LRIG1基因位于人染色體3pl4.3位點，可編碼跨膜糖蛋白，該區(qū)域在人類的許多惡性腫瘤細胞中往往是缺失的[21]。且本研究中LRIG1在正常口腔黏膜、口腔疣狀癌和口腔鱗癌中表達依次降低，LRIG1基因被抑制或者LRIG1基因的缺失，導(dǎo)致其在腫瘤組織中處于低表達或表達缺失，削弱了LRIG1促進腫瘤細胞凋亡的能力，并可能直接或間接影響上皮細胞維持穩(wěn)定的能力，從而導(dǎo)致正常上皮細胞轉(zhuǎn)化為癌變細胞[22]。Nizlsson[23]和Hedman等[24]采用RT-qPCR和western-blot(蛋白質(zhì)印跡技術(shù))方法分析了LRIGl mRNA和蛋白在多種上皮源性腫瘤細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中LRIGI的表達水平缺失或明顯降低。同時相關(guān)的研究顯示LRIG1的過表達具有誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞週亡的作用[15]。這些提示LRIG1基因可能是一種抑癌基因并參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

A： 正常黏膜； B： 口腔疣狀癌癌旁； C： 口腔疣狀癌； D： 口腔鱗癌癌旁； E： 口腔鱗癌； F： 組間比較

圖 1 LRIG1在NM、 OVC和OSCC中的表達(免疫組化， ×400)

A： NM； B： Para-OVC； C： OVC； D： Para-OSCC； E： OSCC tissues； F： Comparison between groups

Fig 1 LRIG1 expression in human NM, OVC and OSCC tissues(IHC， ×400)

A： 正常黏膜； B： 口腔疣狀癌癌旁； C： 口腔疣狀癌； D： 口腔鱗癌癌旁； E： 口腔鱗癌； F： 組間比較

圖 2 Bcl-2在NM、 OVC和OSCC中的表達(免疫組化，×400)

A： NM； B： Para-OVC； C： OVC； D： Para-OSCC； E： OSCC tissues； F： Comparison between groups

Fig 2 Bcl-2 expression in human NM, OVC and OSCC tissues(IHC, ×400)

圖 3 在NM、 OVC和OSCC中LRIG1與Bcl-2的相關(guān)性

Fig 3 The correlation between LRIG1 and Bcl 2 in NM, OVC and OSCC

Bcl-2又稱B淋巴細胞瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/ leuke- mia-2)基因，該基因及表達蛋白可抑制多種組織細胞的凋亡和延長細胞壽命，所以稱為凋亡抑制基因。LRIG1在NM、OVC、OSCC組織中的表達依次下降并伴隨Bcl-2的表達依次升高，LRIG1與Bcl-2呈顯著負相關(guān)。LRIG1在NM組織的高表達增強了對抗凋亡基因Bcl-2的抑制作用，抑制了腫瘤的形成[25]。LRIG1為受體酪氨酸激酶ErbB家族的抑制劑，其抑制ErbB受體功能的作用機制在于LRIG1介導(dǎo)的受體泛素化及受體退化[15]。研究表明，過表達U251膠質(zhì)母細胞瘤細胞中LRIG1將下調(diào)EGFR及Bcl-2的表達水平，從而增加化療藥物敏感性，發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用[26-27]。

綜上所述，LRIG1在口腔疣狀癌中低表達，其表達高低與癌癥惡性度密切相關(guān)，但其具體機制有待進一步研究。而且，LRIG1與Bcl-2表達顯著負相關(guān)，提示LRIG1可能通過降低Bcl-2的抗凋亡作用，促進腫瘤細胞的凋亡或抑制腫瘤細胞的增殖，發(fā)揮抑癌作用，但其具體機制需要進一步研究。

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(收稿： 2016-10-31 修回： 2016-12-12)

LRIG1expressionanditspossiblesuppressorroleinoralverrucouscarcinoma

DENGZhiyuan1,TANGZhangui1,WANGYuehong2,LIYiping3.

1. 410008Changsha,DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery, 2.DepartmentofOralProsthodontics, 3.DepartmentofOralImplantSurgery,theXiangYaStomatologicalHospitalCentralSouthUniversity,China

Objective: To explore leuncine- rich repeats and immunoglobulin- like domains protein 1(LRIG1) expression in oral verrucous carcinoma(OVC) and its possible mechanism of tumor suppression.MethodsParaffin specimens of OVC(n=15) and oral squamous cell carcinoma(OSCC，n=30) and corresponding adjacent normal tissues, and 15 normal mucosa tissues(NM) as control from injured patients were collected. The expression levels of LRIG1 and Bcl-2 were examined using immunohistochemical SP method. The correlation between the expression levels of LRIG1 and Bcl-2 was determined using two tailed Pearson's correlation.ResultsLRIG1 was significantly lower in OVC tissue than that in NM tissue, but higher than in OSCC tissue.The expression levels of Bcl-2 in OVC were significantly higher than that in NM, but lower than in OSCC. The expression level of LRIG1 was negatively correlated with expression level of Bcl-2 in NM, OVC and OSCC tissue.ConclusionLRIG1 may inhibit the expression of Bcl-2 and the development of OVC.

Oralverrucouscarcinoma(OVC)；LRIG1；Bcl-2；Apoptosis

國家自然科學基金面上項目(編號： 81671003);中南大學中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(編號： 2016zzts117)

410008 長沙， 中南大學湘雅口腔醫(yī)院口腔頜面外科(鄧智元 唐瞻貴)， 口腔種植科(王月紅)， 口腔修復(fù)科(李毅萍)

唐瞻貴 E-mail: tangzhangui@aliyun.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.009