Wnt1在口腔黏膜下纖維性變中的表達

邱喜麗 許春姣 王璐 呂逢源 劉婷婷 周美璐 徐文華 吳穎芳 方廠云 彭解英

Wnt1在口腔黏膜下纖維性變中的表達

邱喜麗 許春姣 王璐 呂逢源 劉婷婷 周美璐 徐文華 吳穎芳 方廠云 彭解英

目的研究wnt1在口腔黏膜下纖維性變(OSF)患者治療前后的表達并探討其在OSF發生發展中的作用。方法40 例OSF中期患者采用曲安奈德+丹參局部封閉治療4 周，治療前及第5周復診時記錄VAS及張口度，取唾液及齦溝液ELISA檢測wnt1表達，實時熒光定量PCR檢測OSF病變頰黏膜中wnt1 mRNA表達。結果治療前OSF組wnt1表達[頰黏膜定量PCR(36.89±10.40)×10-5，唾液濃度(61.61±4.45) ng/L，齦溝液濃度(56.20±3.65) ng/L]均高于正常組[頰黏膜定量PCR(4.63±1.53)×10-5，唾液濃度(40.26±3.00) ng/L，齦溝液濃度(53.45±1.74) ng/L](Plt;0.01)；OSF組經治療后，唾液與齦溝液中wnt1表達均降低，且與OSF臨床嚴重程度呈正相關(Plt;0.05)。結論wnt1可能參與OSF的發生發展，其在唾液與齦溝液中的實時監測有望成為評價OSF診療的無創性檢控手段之一。

口腔黏膜下纖維性變(OSF)； wnt1； wnt/β-catenin信號通路

口腔黏膜下纖維性變(oral submucous fibrosis,OSF)是一種具有癌變傾向的斑紋類疾病，臨床表現為張口受限、刺激性疼痛和水皰、潰瘍等，其發生與咀嚼檳榔密切相關[1]，國際上常采用糖皮質激素、蛋白水解酶、抗氧化劑、維生素等藥物治療，但尚未發現安全特效的治療方法。近年我科采用曲安奈德結合丹參治療OSF收到良好療效。OSF的發病機制目前尚不明確，大量研究表明，wnt/β-catenin信號通路在肝、腎、肺、皮膚等器官纖維化進程中起到了關鍵作用，尤其在成纖維細胞的增殖及向肌成纖維細胞的分化中起著調控作用[2]，wnt1是該信號通路的起始蛋白，但在OSF中的研究甚少，鑒于器官纖維化的同質性，推測其可能在OSF中起著一定作用。

目前，局部活檢仍是臨床上常用的診斷OSF的主要方法，但存在有創和術后疼痛等缺點，給治療及疾病預后的監控帶來難題。而唾液及齦溝液取樣方法簡單快捷，安全無創，易被患者接受，已被用來監測牙周和口腔黏膜疾病狀態。故本研究通過檢測OSF患者治療前后唾液及齦溝液中wnt1蛋白的表達水平及臨床指標的改變，探討wnt1與OSF的發生發展關系，為其療效評價提供新途徑。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究2012-03～2014-05于中南大學湘雅醫院口腔科就診患者，均取得知情同意完成本項研究。OSF組納入標準[3]：未經過治療的病理診斷為OSF中期患者。排除標準[3]：合并系統性疾病、牙周炎、其余口腔黏膜疾病。共納入18～50 歲的OSF患者40 例；唾液及齦溝液取樣正常對照組20 例，正常頰黏膜組織20 例取自湘雅醫院口腔頜面外科病房行骨折固定術者。

1.2 治療方案

OSF組：10 mg/ml曲安奈德注射液4 ml，1.5 g/ml丹參注射液4 ml，注射于雙側病損基底部，1 次/周，連續4 周，戒除檳榔、煙、酒，行張口訓練，同時服用鈣片、氯化鉀緩釋片和葡萄糖酸鋅顆粒。

1.3 主要試劑、材料及設備

MB-530多功能酶標分析儀(深圳匯松科技發展有限公司)，熒光定量PCR儀(Thermo公司,美國)，wnt1酶聯免疫分析試劑盒(RD公司,美國)，逆轉錄試劑盒(Fermentas公司,美國)，SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司,美國)。

1.4 臨床資料采集

患者初診及第5周復診時，拍攝口內照片，記錄基本信息、生活習慣、刺激痛、張口度、水皰和潰瘍。刺激痛評價采用視覺模擬評分法(visual analogy scale，VAS)，由患者根據自我疼痛程度來從0～100內選擇相應分數，0代表無疼痛，100代表疼痛最高值。

1.5 唾液及齦溝液采集及ELISA檢測wnt1濃度

在初診及第5周復診時，采取靜態吸引法收集無刺激性混合唾液1 ml[4]，采取標準whatman濾紙條[2 mm×20 mm]分別插入4 個第一磨牙近中頰側齦溝內收集齦溝液，置-80 ℃冰箱保存，采用wnt1酶聯免疫分析試劑盒檢測wnt1的濃度。

1.6 頰黏膜組織收集

OSF受試對象選取右側頰部病變最明顯處，局麻后漱口，用尖刀切取頰黏膜組織約8 mm×8 mm大小，達黏膜下層，一分為二，一份放入RNase-Free Water中漂洗血液及唾液后，置入裝有1 ml RNA保存液的凍存管內，轉存于-80 ℃冰箱；另一份標本送病理診斷。正常組織取自頜骨骨折固定術需行前庭溝切口者。

1.7 實時熒光定量PCR檢測頰黏膜組織中wnt1水平

取頰黏膜組織加入Trizol進行總RNA的提取，取RNA提取液紫外分光光度計測定A260和A280，60份組織標本A260/A280均為1.8～2.0之間，符合要求。進行RNA反轉錄，內參對照采用β-actin，根據GenBank檢索目的基因核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計上下游引物，引物合成委托上海生工有限公司完成。目的基因及內參基因引物序列如下：

wnt1-F: 5'-GGGGTATTGTGAACGTAGCCT-3'

wnt1-R: 5'-CGGATTTTGGCGTATCAGA -3'

β-actin-F： 5'-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3'

β-actin-R: 5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'

PCR反應體系：SYBR Green PCR Master Mix 15 μl,F-Primer(10 μmol/L)0.5 μl, R-Primer (10 μmol/L) 0.5 μl，PCR H2O 13 μl，cDNA 1 μl。每個樣本3 個復孔，反應條件：95 ℃10 min預變性，95 ℃15 s、60 ℃ 1 min擴增40 個循環，獲得各樣本待測基因的CT值。wnt1及β-actin PCR擴增曲線圖分別見圖1～2。

圖 1 wnt1擴增曲線

圖 2 β-actin擴增曲線

1.8 統計學分析

經SPSS 19.0分析，PCR結果采用2-ΔCt法，采用比較Ct法以β-actin為內參對照相對定量wnt1基因的表達水平，取3次實驗平均值。組間基線資料采用pearson卡方檢驗，其余資料比較采用t檢驗，相關分析采用spearman分析，Plt;0.05有統計學意義。

2 結 果

OSF組與正常組wnt1表達水平比較(表 1)。OSF組治療前后刺激痛、張口度、唾液及齦溝液中wnt1水平比較(表 2)。OSF組 wnt1表達水平與臨床指標spearman相關分析(表 3)。

表 1 OSF組及正常對照組wnt1表達水平比較

表 2 OSF組治療前后臨床指標、唾液及齦溝液中wnt1濃度差異比較

表 3 OSF臨床指標與wnt1表達水平相關分析

注： ①Plt;0.05

3 討 論

資料表明，wnt/β-catenin信號通路在組織纖維化進程中起到重要作用。體外實驗證實，wnt蛋白可以誘導上皮細胞增殖、肌成纖維細胞活化增殖以及增加膠原合成[5]。He等[6]在阻塞性腎損傷模型中發現腎小管上皮細胞β-catenin表達顯著增多，wnt/β-catenin信號通路活化，LEF1和纖維連接蛋白表達增強，而運用該通路拮抗劑DKK1后，β-catenin顯著減少且wnt/β-catenin靶基因被抑制，同時，DKK1抑制了肌成纖維細胞的活化，膠原蛋白Ⅰ及纖連蛋白表達下調，導致阻塞腎模型中膠原纖維總量下降。

本研究發現，wnt1在OSF頰黏膜、唾液及齦溝液中的表達明顯高于正常組(Plt;0.05)，表明wnt1在OSF中處于異常高表達狀態，可能提示wnt/β-catenin信號通路在OSF中異常活化，并可能在OSF發生及膠原代謝中起到了一定作用。Akhmetshina等[7]發現纖維化組織中wnt1、wnt10b表達上調，在培養成纖維細胞中加入wnt1，轉錄因子Colla2表達明顯上升且隨wnt1濃度升高而上調，Colla2是指前膠原α2(I)，I型前膠原由2條αl(I)鏈和1條α2(I)鏈組成，是纖維化形成中細胞外基質的主要成分，說明wnt1可能為主要的促纖維化因子，同時wnt1顯著提高了α-SMA、膠原蛋白和mRNA水平，表明wnt1可促進成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化和膠原纖維沉積，且其作用可被DKK1阻斷，進一步證實wnt1在膠原形成中扮演著重要作用。

唾液和齦溝液蛋白成分主要來自血清及口腔局部黏膜上皮，與機體和局部微環境中免疫炎性狀態的改變有關[8-9]，目前關于OSF唾液與齦溝液蛋白定量檢測的報道甚少。隨著OSF疾病的進展，患者口腔黏膜以及牙齦發生纖維化等免疫炎性改變，我們推測，其唾液和齦溝液成分也發生相應的改變，且隨著治療的深入及臨床癥狀的改善，也會有一定的變化。實驗表明，OSF患者經治療后唾液與齦溝液中wnt1濃度均明顯降低(Plt;0.01)，并且下降趨勢與OSF臨床指標張口度和VAS的改善呈正相關，一方面肯定了曲安奈德和丹參治療OSF的效果，另一方面也表明wnt1與OSF的發生發展相關，同時表明唾液和齦溝液中wnt1表達水平有可能反映了OSF疾病的嚴重程度，為OSF的疾病診斷和監測提供一個新的思路，進一步證實可通過檢測治療前后OSF黏膜組織的DNA或RNA、western blot或免疫組化等方法提供更有力的理論依據。

曲安奈德是一種抗炎及免疫抑制作用強大的糖皮質激素藥物，現已廣泛應用于硬皮病、肺間質纖維化、皮膚瘢痕等纖維化疾病的治療，可降低OSF的免疫炎性反應，促進變性的膠原纖維降解。Almeida等[10]研究發現地塞米松可通過抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，從而降低wnt3a和β-catenin的表達。丹參作為一種活血化瘀藥物，能改善微循環障礙。吳穎芳[11]應用丹參聯合小劑量潑尼松龍治療OSF，取得了良好療效；左雯鑫等[12]應用復方丹參滴丸聯合曲安奈德治療OSF患者后病情改善。本研究觀察到40例OSF患者經曲安奈德聯合丹參治療后，唾液及齦溝液中wnt1表達均下降，同時，口腔黏膜疼痛程度亦下降，張口度增加，提示wnt1與OSF的發生發展及臨床嚴重程度相關。

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(收稿： 2016-10-16 修回： 2016-11-19)

Theexpressionofwnt1inoralsubmucousfibrosis

QIUXili1,XUChunjiao2,WANGLu3,LVFengyuan3,LIUTingting3,ZHOUMeilu3,XUWenhua3,WUYingfang2,FANGChangyun2,PENGJieying2.

1. 410008Changsha,XiangyaStomatologicalHospital,CentralSouthUniversity,China; 2.CenterofStomatology,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity，Changsha； 3.SchoolofStomatology,CentralSouthUniversity,Changsha

Objective: To observe the expression of wnt1 in patients with oral submucous fibrosis(OSF) before and after treatment.Methods40 patients with OSF were treated with triamcinolone acetonide combined with salvia miltiorrhiza, Before and after 4 weeks treatment, pain score of VAS and mouth opening(MO) were examined. wnt1 protein in saliva and gingival crevicular fluid(GCF) was examined by ELISA, wnt1 mRNA expression in buccal mucosa tissue was examined by real-time fluorescent quantitative PCR. 20 healthy subjects were served as the controls.ResultsThe expression of wnt1 in OSF group[buccal tissue RT-PCR (36.89±10.40)×10-5,saliva ELISA (61.61±4.45) ng/L，GCF ELISA (56.20±3.65) ng/L] were significantly higher than that of control group[buccal tissue RT-PCR (4.63±1.53)×10-5，saliva ELISA (40.26±3.00) ng/L，GCF ELISA (53.45±1.74) ng/L)](Plt;0.01). In OSF group，after treatment VAS was decreased(Plt;0.01), MO increased(Plt;0.01)), Buccal mucosa wnt1 mRNA level was positively correlated with wnt1 protein in saliva and GCF, negativity with MO(Plt;0.05), saliva wnt1 was positively correlated with VAS and GCF wnt1, negitively with MO(Plt;0.05).ConclusionWnt1 might take part in the occurrence and development of OSF. The detection of wnt1 in saliva and GCF might be a noninvasive method for the evaluation of OSF treatment.

Oralsubmucousfibrosis(OSF);Wnt1;Wnt/β-cateninsignalingpathway

教育部留學回國人員科研啟動基金(編號： 教外司留【2012】940)； 湖南省科技計劃項目(編號： S2014FJ3152)

410008 長沙， 中南大學湘雅口腔醫院(邱喜麗)； 中南大學湘雅醫院口腔醫學中心(許春姣 吳穎芳 方廠云 彭解英)； 中南大學口腔醫學院(王璐 呂逢源 劉婷婷 周美璐 徐文華)

許春姣 0731-84327495 E-mail: chunjiaoxu @126.com

R781.5

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.017