富血小板纖維蛋白提取液對經TNF-α刺激下人牙周膜細胞的影響

許晶晶 羅子源 雷蕾

富血小板纖維蛋白提取液對經TNF-α刺激下人牙周膜細胞的影響

許晶晶 羅子源 雷蕾

目的檢測富血小板纖維蛋白提取液(PRFe)對腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激下的人牙周膜細胞(hPDLCs)成骨分化能力的影響。方法組織塊法分離培養hPDLCs，免疫組化鑒定其來源；Choukroun法制取PRFe；實驗分為空白對照組、TNF-α(10 ng/ml)組、PRFe組和PRFe+TNF-α(10 ng/ml)組。堿性磷酸酶試劑盒檢測ALP活性；茜素紅染色觀察細胞礦化功能；Western blotting檢測Runx2、Osterix蛋白含量。結果ALP活性檢測、茜素紅染色和Western blotting結果顯示TNF-α組各項指標均低于空白對照組(Plt;0.05)，PRFe組各項指標均高于空白對照組(Plt;0.05)，PRFe+TNF-α組各項指標均高于TNF-α組(Plt;0.05)，PRFe組各項指標均高于PRFe+TNF-α組(Plt;0.05)。結論PRFe可促進經TNF-α刺激的hPDLCs成骨分化。

富血小板纖維蛋白提取液(PRFe)； 腫瘤壞死因子α(TNF-α)； 人牙周膜細胞(hPDLCs)； 成骨分化

2000 年法國學者Choukroun[1]發明了第二代血小板濃縮制品-富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin extract, PRF)，其內包含可促進組織再生的生長因子，有學者用PRFe替代PRF膜進行實驗，發現PRFe亦包含大量生長因子[2]，可促進細胞增殖及成骨分化[3-5]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是牙周炎發生的關鍵病理因子[6]，可顯著抑制細胞成骨分化[7-10]。國內外文獻報道多將PRF作用于正常培養的細胞，尚未見將PRF作用于炎癥環境中以觀察細胞活性的實驗研究。本實驗通過觀察PRFe對經TNF-α刺激后的hPDLCs成骨分化及礦化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM 培養液、0.25%胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素(Gibco，美國)；胎牛血清FBS(四季青，杭州)；兔抗人波形絲蛋白、角蛋白ck14(中杉金橋，北京)；免疫組化試劑盒(博士德，武漢)；TritonX-100、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、DMSO(Sigma，美國)；人重組TNF-α(Peprotech，美國)，堿性磷酸酶試劑盒(南京建成)，茜素紅(上海源葉)，BCA蛋白含量測定試劑盒(凱基生物)，鼠抗人Runx2抗體(CST，美國)，兔多克隆Osterix抗體(Abcam，美國)。

1.2 方法

1.2.1 hPDLCs的原代培養及鑒定 收集因正畸拔除的新鮮且無牙周炎癥的前磨牙，實驗在志愿者簽署知情同意書后進行。用生理鹽水沖洗根面血污后立即置于預冷的DMEM培養液中(含500 U/ml青霉素、500 mg/L鏈霉素)保存備用。快速轉移至超凈臺中，組織塊法行細胞培養。取第2代細胞行波形絲蛋白、角蛋白的免疫組化鑒定。

1.2.2 PRFe的制備 4 名健康志愿者在簽署知情同意書后進行血液采集，具體步驟如下：使用2 支無抗凝劑的5 ml一次性真空采血管抽取上肢靜脈血，立即以400 g離心力離心10 min，靜置后分為4 層，中間層即為PRF。在超凈臺中將PRF取出，無菌紗布輕壓10 s成膜狀，浸泡于5 ml新鮮DMEM培養基內，置于37 ℃培養箱中，于第7天后取出浸出液，400 g離心力離心5 min沉淀紅細胞，0.22 μm無菌濾器過濾除菌，分裝，獲得PRFe原液，-80 ℃低溫保存備用。每次換液均現配現用，DMEM培養液稀釋PRFe原液至50%體積分數即為本實驗所用PRFe[2-5]。

1.2.3 實驗分組 ①空白對照組：礦化誘導液 (0.1 μmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml維生素C、10%FBS);②TNF-α組：10 ng/ml TNF-α的礦化誘導液;③PRFe組：PRFe礦化誘導液;④PRFe+TNF-α組：10 ng/ml TNF-α的PRFe礦化誘導液。

1.2.4 堿性磷酸酶活性測定 將細胞計數約2×104個/ml的細胞懸液接種至12 孔板(1 ml/孔)，每組3 復孔。按照上述實驗分組加入相應培養基，分別培養7、14 d后，每孔加入200 μl 1%TritonX-100裂解細胞，4 ℃過夜。按照堿性磷酸酶試劑盒以及BCA蛋白含量檢測試劑盒說明書檢測各組ALP活性。

1.2.5 茜素紅染色法 將細胞計數約2×104個/ml的細胞懸液接種至12 孔板(1 ml/孔)。按照上述實驗分組加入相應培養基，分別培養7、14、21 d后，適量多聚甲醛固定后加入適量無菌0.1%茜素紅，37 ℃孵箱內放置30 min，雙蒸水清洗，拍照。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件隨機選取3 個視野進行掃描以測定染色礦化結節的積分吸光度A值。

1.2.6 Western blotting檢測蛋白含量 將細胞計數約4×104個/ml的細胞懸液接種至6 孔板(2 ml/孔)。按照上述實驗分組加入相應培養基，培養14 d后，提取細胞蛋白，通過BCA法確定蛋白的濃度。蛋白變性后，經SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，通過濕轉法印跡到PVDF膜上，封閉，Runx2、OSX一抗4 ℃敷育過夜，與HRP所標記的二抗結合，加入ECL發光液，凝膠成像系統曝光成像。實驗結果經Alpha Ease FC軟件進行定量分析。

1.3 統計學分析

圖像分析用Image Pro-Plus 6.0、AlphaEaseFC軟件。定量指標用SPSS 19.0 軟件進行統計學處理，運用方差分析和組間兩兩比較的LSD檢驗，檢驗水準均取雙側α=0.05，分析結果是否具有統計學意義。

2 結 果

2.1 hPDLCs的原代培養以及免疫組化鑒定結果

14 d左右可見長梭形細胞從組織塊邊緣爬出(圖 1A)；免疫組化鑒定結果顯示：波形絲蛋白染色陽性(圖 1B),角蛋白14染色陰性(圖 1C)，證實細胞為間充質而非上皮性來源。

A: 相差顯微鏡觀察(×100); B: 波形絲蛋白染色陽性(免疫組化染色，×100); C: 角蛋白14染色陰性(相差顯微鏡觀察，×100)

A: Phase contrast microscope(×100); B: Positive reaction of cells to antibodies against vimentin(IHC，×100); C: Negative reaction of cells to antibodies against keratin 14(IHC，×100)

Fig 1 The morphology and identification staining of human periodontal ligament cells

2.2 PRFe的制備

見圖 2。

圖 2 PRF和PRFe的制備

2.3 堿性磷酸酶法檢測ALP活性

根據重復測量的方差分析，ALP活性隨著時間的變化與處理因素有關 (F=469.300，P=0.000)，在各時間點經組間兩兩比較ALP活性發現：TNF-α組lt;空白對照組；PRFe組gt;空白對照組；PRFe組gt;PRFe+TNF-α組； PRFe+TNF-α組gt;TNF-α組，且差別均具有統計學意義(Plt;0.05)(表 1)。

2.4 茜素紅染色

空白對照組、PRFe、PRFe+TNF-α組在細胞培養第21天均形成不透光的礦化結節，鏡下可見重疊生長的細胞呈結節狀，膠原堆積。其中PRFe組形成結節時間早，面積大，數量多。而TNF-α組第21天仍未見細胞復層生長，也無礦化結節形成(圖 3)。

運用Image Pro-Plus 6.0進行定量分析，根據重復測量的方差分析，各組A均值隨著時間的變化與處理因素有關(F=6 041.989，P=0.000)，在各時間點經組間兩兩比較A均值發現：TNF-α組lt;空白對照組；PRFe組gt;空白對照組；PRFe組gt;PRFe+TNF-α組；PRFe+TNF-α組gt;TNF-α組，且差別均具有統計學意義(Plt;0.05)(表 2)。

Tab 1 ALP activity of hPDLCs in different groups (±s, n=3)

注： ①與TNF-α組相比，Plt;0.05； ②與PRFe組相比，Plt;0.05； ③與空白對照組相比，Plt;0.05

Tab 2 Integrate optical density of hPDLCs in different groups after Alizarin red staining (A, ±s, n=3)

注： ①與TNF-α組相比，Plt;0.05； ②與PRFe組相比，Plt;0.05； ③與空白對照組相比，Plt;0.05

2.5 Western blotting檢測蛋白表達

用AlphaEase FC軟件進行定量分析。經組間兩兩比較Runx2、OSX蛋白表達發現，TNF-α組lt;空白對照組；PRFe組gt;空白對照組；PRFe組gt;PRFe+TNF-α組；PRFe+TNF-α組gt;TNF-α組，且差別均具有統計學意義(Plt;0.05)(圖 4)。

3 討 論

牙周炎是累及牙周支持組織的炎癥性、破壞性疾病。近年來，牙周組織再生成為國內外學者研究熱點，其三大基本要素包括：種子細胞、信號分子和支架材料。

本實驗通過使用hPDLCs作為種子細胞，以PRF內生長因子作為信號分子，觀察細胞活性。其中，hPDLCs增殖能力強，具有干細胞特性[11]；PRF中富含各種生長因子如血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、轉化生長因子-β(transforming growth factor β, TGF-β)、胰島素生長因子(Insulin-like growth factors, IGF)等[2]，這些生長因子比例接近人體正常生理狀態，解決了外源性生長因子難以配伍、價格昂貴等問題。國內外學者發現，PRFe可促進細胞增殖，上調ALP活性，增強礦化能力，上調成骨相關基因表達[3-5]，本實驗參考現有文獻[2-5]制備PRFe，發現PRFe組各項指標均大于空白對照組，可認為PRF可上調正常培養狀態下的hPDLCs成骨效能。

圖 3 茜素紅染色(×40)

Fig 3 Alizarin red staining(×40)

圖 4 實驗各組第14天成骨相關蛋白

TNF-α是牙周炎癥發生發展及牙槽骨吸收過程中重要的炎癥因子[6]，國內外學者發現TNF-α可顯著抑制hPDLCs及間充質干細胞增殖及ALP活性[7-8]，亦可通過激活NF-κB信號，抑制外源性BMP2-Samds信號通路誘導的下游轉錄因子Runx2的表達，從而抑制成骨[9]。Yang等[10]利用TNF-α(10 ng/ml)構建炎癥微環境，發現牙齦間充質干細胞和牙周膜干細胞的成骨效能均下降。本實驗參考現有文獻[7-10]模擬體外炎癥微環境，發現TNF-α組(10 ng/ml)的ALP活性、礦化能力、Runx2蛋白表達均弱于空白對照組，與上述文獻結果一致[7-10]。可見運用TNF-α建立體外炎癥微環境具有可行性。

本研究利用TNF-α模擬體外炎癥微環境，并加入PRFe，觀察hPDLCs在炎癥刺激狀態下的成骨效能。ALP活性的高低可反映細胞成骨方向轉化的趨勢大小，茜素紅染色形成的礦化結節是成骨細胞分化成熟的標志。Runx2是調控細胞成骨分化的特異性轉錄因子，在多個成骨信號通路中起著核心的作用[12]。Osterix是一種鋅指結構的成骨特異性轉錄因子，研究表明在Osterix基因缺失的小鼠中，無骨形成發生[13]。本實驗通過檢測各組細胞ALP的活性，礦化結節形成和Runx2、OSX表達，判斷各組細胞的成骨能力。通過比較PRFe組和PRFe+TNF-α組各項指標發現，PRFe組的ALP活性強于PRFe+TNF-α組；茜素紅染色可見2 組均有明顯的礦化結節形成，但PRFe組染色更深，面積更大，形成更早；Western blotting結果顯示PRFe組蛋白表達強于PRFe+TNF-α組，說明TNF-α(10 ng/ml)在有PRFe作用的實驗組中亦可起到抑制作用。同樣，比較TNF-α和PRFe+TNF-α組各項指標發現，PRFe+TNF-α組的ALP活性強于TNF-α組；茜素紅染色結果直觀顯示出TNF-α組不僅細胞密度低，也未見礦化結節形成，而PRFe+TNF-α組鏡下可見礦化結節染色深，面積大，密度高，其A值甚至高于空白對照組；Western blotting結果顯示PRFe+TNF-α組蛋白表達強于TNF-α組。可見，即使在有炎癥因子刺激的前提下，PRFe培養的hPDLCs仍具有良好的增殖活性、成骨分化及礦化能力。其機制可能由于PRFe中所包含的生長因子拮抗TNF-α對細胞產生的抑制作用，如TGF-β1可磷酸化Samd2/Samd3上調Runx2轉錄[14]，從而拮抗TNF-α激活NF-κB信號通路下調Runx2的作用。綜上，PRFe不僅對于正常培養的hPDLCs具有成骨作用，且運用TNF-α模擬炎癥微環境的前提下，PRFe仍可促進hPDLCs成骨。

PRF是否具有抗炎能力仍值得探討與研究。Dohan等[15]提出PRF可作為免疫節點增強機體抗感染能力，PRF能否減輕局部免疫反應仍有待進一步驗證。此外，本實驗采用單一炎癥因子模擬牙周微環境，具有一定的局限性，PRF能否促進在其他炎癥因子刺激下的hPDLCs成骨分化，待后續實驗進一步探索。

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(收稿： 2016-08-27 修回： 2016-12-14)

Theeffectsofplatelet-richfibrinextractonhumanperiodontalligamentcellsstimulatedbyTNF-αinvitro

XUJingjing1,LUOZiyuan2,LEILei1.

1. 510632Guangzhou,DepartmentofStomatology,MedicalCollege,Ji'nanUniversity,China; 2.DepartmentofStomatology,ShenzhenPeople'sHospital

Objective: To investigate the effects of platelet-rich fibrin extract (PRFe) on the osteogenetic differentiation and mineralization of human periodontal ligament cells(hPDLCs) stimulated by tumor necrosis factor-α(TNF-α)invitro.MethodshPDLCs were cultured and identified. PRFe was obtained by Choukroun's protocols. The cells were treated as the 4 groups: ① the blank control group, ②TNF-α(10 ng/ml), ③ PRFe and ④PRFe +TNF-α(10 ng/ml) respectively. Alkaline phosphatase activity was detected by the ALP kit. The alizarin red dye was used to observe the mineralization of the cells. Runx2 and Osterix expression was quantified by Western blotting.ResultsThe ALP activity, mineralization level and the expression of Runx2 and Osterin of the TNF-α group were lower that those of the control group(Plt;0.05). The examined indexs of PRFe group were higher than that of the control group(Plt;0.05). The indexs of the PRFe+TNF-α group were higher than that of TNF-α group(Plt;0.05) . The indexs of PRFe group were higher than that of PRFe+TNF-α group(Plt;0.05).ConclusionPRFe may promote the osteogenetic differentiation of hPDLCs stimulated by TNF-αinvitro．

Platelet-richfibrinextract(PRFe)；Tumornecrosisfactor-α(TNF-α)；Humanperiodontalligamentcells(hPDLCs)；Osteogeneticdifferentiation

廣東省自然科學基金(編號： 8151063201000065)

510632 廣州, 暨南大學醫學院口腔醫學系(許晶晶 雷蕾)； 深圳市人民醫院口腔科(羅子源)

雷蕾 020-85220266 E-mail: tleil@jun.edu.cn

Q813.1+1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.018