LncRNA H19與OSF發(fā)生及癌變的關(guān)系

蘇花 周珅玥 郭新程 王海青 李翠 黃建華

LncRNA H19與OSF發(fā)生及癌變的關(guān)系

蘇花 周珅玥 郭新程 王海青 李翠 黃建華

目的探討lncRNA H19在口腔黏膜下纖維性變(OSF)發(fā)生及癌變過(guò)程中的表達(dá)變化及其意義。方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)12 例正常頰黏膜組織、33 例OSF頰黏膜組織、31 例伴OSF頰癌組織中的LncRNA H19的表達(dá)水平。結(jié)果LncRNA H19在頰黏膜組織、OSF頰黏膜組織、伴OSF頰癌組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.17±0.37、3.44±1.08、8.88±1.78，組間兩兩之間比較，Plt;0.01。結(jié)論LncRNA H19可能參與OSF的發(fā)生及癌變。

口腔黏膜下纖維性變； 癌變； LncRNA H19

口腔黏膜下纖維性變(oral submucous fibrosis，OSF)由Schwartz在1952年首次報(bào)道并命名，是一種慢性進(jìn)行性并且具有癌變傾向的口腔黏膜疾病，主要發(fā)生于印度、巴基斯坦等東南亞地區(qū)，我國(guó)主要見(jiàn)于湖南和臺(tái)灣2 省[1]。1956 年P(guān)aymaster[2]首次報(bào)道OSF具有癌變傾向，之后的研究也證實(shí)了類似現(xiàn)象，并被WHO口腔癌前病變研究中心列為癌前狀態(tài)，但報(bào)道的癌變率存在較大差異，區(qū)間在2%～8%之間[1]。近年來(lái)，針對(duì)OSF的具體發(fā)病機(jī)制及癌變誘導(dǎo)因素的研究不斷被報(bào)道，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)檳榔中的檳榔堿、亞硝基胺和煙草中的尼古丁等致癌成分能夠參與OSF的癌變，然而具體誘變機(jī)制仍然不清楚[3-4]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA) 是一類長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸、不具有蛋白質(zhì)編碼功能的轉(zhuǎn)錄本，以往一直被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄的暗物質(zhì)和副產(chǎn)物[5]。但近年來(lái)的研究表明lncRNA在劑量補(bǔ)償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)紊亂與多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[5-7]。H19 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的lncRNA，僅在胚胎組織中表達(dá)，在成年組織中一般不表達(dá)，但在組織再生及腫瘤發(fā)生時(shí)被重新激活[8]。LncRNA H19的印跡缺失已經(jīng)被認(rèn)為是癌癥發(fā)生的早期事件，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著非常重要的角色，是繼p53 基因之后在腫瘤分子生物學(xué)上又一重大發(fā)現(xiàn)[9]。目前國(guó)內(nèi)外均有大量文獻(xiàn)研究H19在不同疾病和腫瘤中的表達(dá)及作用機(jī)制[6-7]，OSF作為癌前狀態(tài)，具有一定的癌變傾向，而關(guān)于H19在OSF的發(fā)生及癌變過(guò)程中所扮演的角色目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。我國(guó)湖南省、海南省及臺(tái)灣作為世界上口腔黏膜下纖維化及口腔癌發(fā)生率較高的地區(qū)，研究口腔黏膜下纖維化發(fā)生發(fā)展及癌變過(guò)程中可能存在的特異性標(biāo)記分子，為針對(duì)性基因治療提供理論基礎(chǔ)具有重要意義。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)初步研究了H19在正常頰黏膜、OSF、伴有OSF頰癌組織中分子水平的表達(dá)，探索H19在OSF發(fā)生及癌變過(guò)程中的潛在臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本收集

選2014-01～2014-09中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院口腔科及中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院頭頸外科就診及住院的OSF患者及伴OSF頰癌患者共64 例，均未經(jīng)特殊治療、無(wú)其他系統(tǒng)疾病，其中口腔黏膜下纖維性變患者33例，伴口腔黏膜下纖維性變頰癌患者31 例(均為患者先出現(xiàn)OSF癥狀,后出現(xiàn)口腔癌變,取其口腔癌變組織部分)，正常口腔頰黏膜組織12 例(均為志愿者，且無(wú)煙、檳榔嗜好，無(wú)口腔黏膜疾病)，上述標(biāo)本依次分入OSF頰黏膜組、伴OSF頰癌組和正常頰黏膜組。所有患者均簽署知情同意書(shū)，活檢組織標(biāo)本分2 份，一份固定于10%甲醛溶液中送中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院病理科獲得病理診斷書(shū)，另一份于液氮罐中保存。

1.2 材料

Trizol(美國(guó) Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(立陶宛 Fermentas)，SYBR Green PCR Master Mix(美國(guó) ABI)，Tris、瓊脂糖、DEPC水(美國(guó) Sigma),引物由南京金斯瑞公司合成。其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取 正常頰黏膜組織、OSF頰黏膜組織和伴有OSF的頰癌組織從液氮中取出后，迅速在液氮下研磨組織標(biāo)本，使用Trizol法對(duì)研磨后的組織進(jìn)行RNA抽提，按說(shuō)明書(shū)操作要求抽提總RNA，用紫外分光光度儀測(cè)定RNA A260和A280的吸光度值。RNA純度=A260/A280，實(shí)驗(yàn)中比值均在1.8～2.0之間，表明樣本純度較好，無(wú)明顯污染。進(jìn)一步采用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA的質(zhì)量。

1.3.2 cDNA 反轉(zhuǎn)錄合成 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，取1 μg RNA，依次加入反應(yīng)試劑，以終體積20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行 cDNA 反轉(zhuǎn)錄合成。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，70 ℃ 5 min。反應(yīng)產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè) 參照SYBR Green PCR Master Mix(美國(guó) ABI)試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用7900HT Fast Real-Time PCR儀( 美國(guó)ABI)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)檢測(cè)組織中l(wèi)ncRNA H19的表達(dá)水平。H19上游引物序列：5'-CCGTCTCCACAACTCCAACCAG-3'，下游引物序列5'-TCAAAGCCTCCACGACTCTGTTT-3'。使用GAPDH作為內(nèi)參基因，GAPDH的上游引物序列：5'- CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3'，下游引物序列：5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'。反應(yīng)條件: 95 ℃ 10 min, 1 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。上機(jī)反應(yīng)后的數(shù)據(jù)先用內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行標(biāo)化，并用2-ΔΔCT值來(lái)表示lncRNA H19的相對(duì)表達(dá)水平。每個(gè)樣本檢測(cè)均重復(fù)3 次，取其平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以上數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，首先用完全隨機(jī)方差分析分析，得出有差異以后，再用Dunnet-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間的比較，Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)H19基因的表達(dá)水平

正常頰黏膜組織、OSF頰黏膜組織和伴有OSF的頰癌組織中均檢測(cè)到H19基因的表達(dá)，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布(Pgt;0.05)。正常頰黏膜、OSF頰黏膜組織和伴有OSF的頰癌組織中H19基因的相對(duì)表達(dá)量分別為1.17±0.37，3.44±1.08，8.88±1.78(圖 1～3)。

圖 1 H19在正常頰黏膜中的表達(dá)水平

2.2 H19基因在OSF組織、OSF癌變組織和正常頰黏膜組織中的表達(dá)情況

采用Dunnet-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩之間的統(tǒng)計(jì)比較，結(jié)果顯示，H19基因在伴有OSF的頰癌組織較OSF頰黏膜組織中的表達(dá)水平明顯升高(Plt;0.01)，其在OSF頰黏膜組織中的表達(dá)水平比正常頰黏膜組織中的表達(dá)水平也明顯升高(Plt;0.01)(圖 4)，且H19基因在正常頰黏膜、OSF頰黏膜組織中和伴有OSF的頰癌組織中的相對(duì)表達(dá)量成升高趨勢(shì)。

圖 2 H19在OSF頰黏膜組織中的表達(dá)水平

圖 3 H19在伴OSF頰癌組織中的表達(dá)水平

圖 4 3 組樣本中H19相對(duì)表達(dá)量的比較

3 討 論

LncRNA H19是最早發(fā)現(xiàn)的一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA，定位于人染色體llpl5.5區(qū)。在正常組織內(nèi)，H19為母系等位基因表達(dá)，父系等位基因沉默的印跡基因。印跡基因表達(dá)異常，包括印跡獲得(gain of imprinting，GOI)和印跡丟失(loss of imprinting，LOI)，可引起一系列生理病理改變甚至腫瘤的發(fā)生。研究表明，H19在多種腫瘤中都存在異常表達(dá)，異常表達(dá)的H19能夠影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖分化、血管形成等生理過(guò)程從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。而對(duì)人類口腔黏膜及其癌前病變的lncRNA 表達(dá)圖譜分析[11]，發(fā)現(xiàn)了超過(guò)60% lncRNA(325 種)在癌組織中存在異常表達(dá)，其中包括lncRNA H19，但尚無(wú)相關(guān)功能研究報(bào)道。

口腔黏膜下纖維化作為一種癌前狀態(tài)，具有一定的癌變能力。因此，尋找能夠指示導(dǎo)致口腔黏膜下纖維病變的特異性標(biāo)記分子，對(duì)預(yù)防口腔黏膜下纖維性變的發(fā)生及癌變具有重要意義。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞，尤其是肌成纖維細(xì)胞在OSF的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[12]。異常表達(dá)的H19基因在纖維化的發(fā)生過(guò)程中的相關(guān)研究已有報(bào)道，如章杰等[13]首次報(bào)道了H19 的過(guò)量表達(dá)與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，下調(diào)H19的表達(dá)可以抑制mTOR 和 VEGF 的產(chǎn)生，從而抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖。而H19基因在不同階段的口腔病理狀態(tài)的表達(dá)水平及其與OSF發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系目前還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究從3 個(gè)不同階段的口腔病理狀態(tài)著手，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了正常頰黏膜組織、OSF頰黏膜組織和伴有OSF的頰癌組織中3 個(gè)不同階段H19的表達(dá)水平，結(jié)果表明，H19的表達(dá)在3 個(gè)不同階段的口腔病理狀態(tài)呈逐漸增高的趨勢(shì)，H19基因在伴有OSF的頰癌組織較OSF頰黏膜組織中的表達(dá)水平明顯升高，其在OSF頰黏膜組織中的表達(dá)水平比正常頰黏膜組織中的表達(dá)水平也明顯升高，表明H19和口腔黏膜纖維化的發(fā)生及癌變有一定的聯(lián)系，提示H19具有成為口腔黏膜下纖維性變發(fā)生發(fā)展及癌變的生物標(biāo)記物的可能，為其后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究及相關(guān)臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),研究將進(jìn)一步探討H19在口腔黏膜下纖維化發(fā)生發(fā)展及癌變過(guò)程中的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制，明確其表達(dá)升高的原因及其與OSF的預(yù)后之間的關(guān)系。

綜上所述，H19在OSF組織和伴有OSF的頰癌組織表達(dá)明顯上調(diào)，提示H19可能參與了OSF的發(fā)生及癌變，可作為口腔黏膜下纖維性變的潛在生物標(biāo)記物，其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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(收稿： 2016-12-24 修回： 2016-01-21)

TherelationshipofLncRNAH19withtheoccurrenceandthecarcinogenesisofOSF

SUHua,ZHOUShenyue,GUOXincheng,WANGHaiqing,LICui,HUANGJianhua.

410013Changsha,DepartmentofStomatology,thirdXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,China

Objective: To study the significance of H19 gene in the progress from normal mucosa through oral submucous fibrosis(OSF) to carcinogenesis.MethodsReal-time fluorescent quantitative PCR technique was used to detect LncRNA H19 expression level in 12 cases of normal buccal mucosa tissue, 33 cases of OSF buccal mucosa tissue and 31 cases of buccal carcinoma with OSF.ResultsThe relative expression levels of LncRNA H19 in normal buccal mucosa tissues, OSF buccal mucosa tissue and buccal carcinoma with OSF tissue were 1.17±0.37, 3.44±1.08 and 8.88±1.78 respectively(between each 2 groups,Plt;0.01).ConclusionH19 may involve the occurrence and canceration of OSF.

Oralsubmucousfibrosis(OSF);Carcinogenesis;LncRNAH19

2015 湖南省保健專項(xiàng)資金科研課題( 編號(hào): B2015-05)

410013 長(zhǎng)沙，中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院口腔科

郭新程E-mail: guoxinchengf3@126． com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.020