托吡酯對蛛網膜下腔出血后神經細胞凋亡影響及機制的實驗研究

曹杰 范成普★ 杜杭根 周冰之 王承 郝必烈

·論著·

托吡酯對蛛網膜下腔出血后神經細胞凋亡影響及機制的實驗研究

曹杰 范成普★ 杜杭根 周冰之 王承 郝必烈

目的從神經細胞凋亡角度探討托吡酯（TPM）對實驗性大鼠蛛網膜下腔出血（SAH）后早期腦損傷（EBI）的神經保護作用，從而為臨床應用提供理論依據。方法取140只健康雄性SD大鼠，隨機分為5組，分別為假手術組（20只）、SAH模型組（30只）和SAH＋TPM干預組（90只平均分為3組，術后2h分別予TPM 20mg/kg、40mg/kg及80mg/kg腹腔注射）。利用頸內動脈穿刺法制作蛛網膜下腔出血模型，對各組在制模后24h進行死亡率統計和神經行為學評分，采用干濕重法檢測腦水腫指數，TUNEL/NeuN/DAPI/Merge熒光染色觀察神經元細胞凋亡，Western blot法評估Caspase-3及Bcl-2、Bax凋亡相關蛋白表達情況。結果與假手術組比較，SAH模型組和各TPM干預組的死亡率和腦水腫指數上升，神經學評分降低。與SAH模型組比較，3個TPM干預組的神經學評分均上升，腦水腫指數均下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。大鼠SAH后24h，Caspase-3及Bcl-2、Bax凋亡相關蛋白表達增強，凋亡細胞增加。TPM干預后，Caspase-3和促凋亡蛋白Bax表達減少，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達增加，凋亡細胞數目有所減少，且這種效應與劑量呈正相關。結論TPM可能通過抑制Caspase-3、Bax表達，促進Bcl-2表達，從而減輕SAH后神經元細胞繼發性凋亡損傷，在神經功能保護方面具有積極作用。

托吡酯 蛛網膜下腔出血 早期腦損傷 細胞凋亡 凋亡相關蛋白

蛛網膜下腔出血（SAH）是指腦底部或腦表面的病變血管破裂，血液直接流入蛛網膜下腔引起的一種臨床綜合征，其死亡率高達50%，1/3的人預后不良[1]。SAH后早期腦損傷（EBI）是指SAH發病后72h內產生的顱腦損傷，減輕SAH后EBI對于改善患者預后具有重要意義，如在EBI期間聯用擴張血管、改善微循環、平衡代謝和抗炎、抗氧化應激、抗血小板的藥物，能有效防治再出血、血管痙攣及腦水腫等并發癥，從而改善患者預后。托吡酯（TPM）除了抗癲癇作用，還具有顯著的神經保護作用，已在缺血缺氧性腦損傷等研究中得到證實[2]，但其在蛛網膜下腔出血后早期腦損傷治療方面的應用還缺乏相關研究。

1 材料與方法

1.1 材料 健康的成年雄性SD大鼠140只，購于浙江中醫藥大學動物實驗中心。術前置于空氣過濾的環境，保持溫濕度一致，自由獲取食物和水。

1.2 方法 （1）分組：140只大鼠隨機分為5組，分別為假手術組（20只）、SAH模型組（30只）和SAH＋TPM干預組（90只平均分為3組，術后2h分別予TPM 20mg/kg、40mg/kg及80mg/kg腹腔注射）。（2）模型制作：頸內動脈穿刺法SD大鼠蛛網膜下腔出血模型[3]：取實驗用SD大鼠，用1%戊巴比妥鈉（50m/kg）腹腔注射麻醉后仰臥固定，右側股動脈插管監測血壓及動脈血氣，術前及蛛網膜下腔出血后各抽取一次動脈血行血氣分析。固定頭部及四肢，頸前部備皮、消毒，取頸部正中切口，鈍性分離暴露右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA）結扎切斷ECA和ICA之間的吻合支，將ECA結扎并切斷拉直，使其與ICA成一直線。取3.0單股尼龍線50mm（3號漁線）將頭端銳化，于線端18.5mm處作標記，將尼龍線從頸外動脈置入頸內動脈的顱內段，插入深度為18.5mm左右，當感覺有阻力時再前進3mm刺破血管，造成蛛網膜下腔出血，大約15s后迅速將尼龍線拔出，用絲線結扎頸外動脈殘端，恢復血流，縫合頸部切口，術中維持肛溫37℃。假手術組除了不刺破血管壁外，其余操作均與SAH模型組一致。麻醉未清醒前給予電熱毯保暖，術后大鼠單籠飼養，注意保暖。（3）取腦固定方法：用2%戊巴比妥鈉（0.12ml/50g）腹腔注射麻醉后，迅速開胸暴露心臟，灌注固定后取腦固定2～4h，分別置于15%和30%蔗糖梯度溶液中直至標本沉底。冰凍切片機作連續冠狀切片，取海馬和齒狀回互包平面，片厚30μm。（4）給藥方式：TPM干預組于制模后2h，予不同劑量TPM腹腔注射（20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg），假手術組和SAH模型組在同等條件下注射等量生理鹽水。

1.3 觀察指標 （1）死亡率和行為學分析：制模后24h為評估時間點，統計大鼠死亡率，進行神經行為學評分[4]，最低分3分，最高分18分。（2）腦組織水含量測定：各組大鼠制模后24h完成上述指標統計后斷頭取腦，采用干、濕重法，取傷側大腦半球腦組織標本，電子天平稱取濕重（溫度20℃～25℃，濕度70%～90%），然后將標本置于（100±2）℃恒溫干燥箱內24 h烘干至恒重，稱取干重，腦組織含水量＝（濕重-干重）/濕重×100%。（3）凋亡途徑相關指標檢測：采用TUNEL/NeuN/DAPI/Merge熒光染色觀察神經元細胞凋亡，Western blot方法評估Caspase-3及Bcl-2、Bax凋亡相關蛋白表達情況。

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 死亡率、神經行為學評分和腦組織水腫指數 假手術組的大鼠未發生死亡，SAH模型組和各TPM干預組之間的死亡率無顯著差異。與假手術組比較，SAH能導致SAH模型組和各TPM干預組的神經學評分降低，腦水腫指數增高，隨著TPM給藥劑量的增加，神經學評分逐漸上升，腦水腫指數逐漸下降。與SAH模型組比較，經TPM治療后，上述指標均有不同程度改善，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中小劑量TPM減輕腦水腫作用不明顯，中等劑量和高劑量TPM對腦水腫有明顯的緩解作用，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 制模后24h各組大鼠死亡率、神經行為學評分和腦水腫指數（±s）

表1 制模后24h各組大鼠死亡率、神經行為學評分和腦水腫指數（±s）

注：與SAH模型組比，*P＜0.05，#P＜0.05；與TPM20mg/kg組腦水腫指數比較，▲P＜0.05

組別死亡率（%）神經學評分（分）腦水腫指數（%）假手術組0（0/20）18.0±0.076.3±1.8 SAH模型組26.67（8/30）8.6±2.279.9±1.5 TPM20mg/kg30.00（9/30）9.4±0.7*79.9±1.7#TPM40mg/kg23.33（7/30）11.1±0.9*76.9±1.7#▲TPM80mg/kg26.67（8/30）11.5±0.8*76.9±1.8#▲

2.2 神經元細胞凋亡情況 與假手術組比較，SAH模型組和各TPM干預組中可觀察到更高比例綠色標記的凋亡細胞，Caspase-3及Bcl-2、Bax凋亡相關蛋白表達增強。經TPM治療后，綠色標記的凋亡細胞比例隨著給藥劑量增加而逐漸下降，Caspase-3和促凋亡蛋白Bax表達減少，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達增加，且這種效應與劑量呈正相關。見圖1、2。

圖1 各組大鼠大腦皮層TUNEL/NeuN/DAPI/Merge熒光染色的代表性顯微照片

圖2 各組大鼠Caspase-3和Bax 、Bcl-2表達情況

3 討論

蛛網膜下腔出血是一種常見的神經系統疾病，其致死和致殘的主要原因可能是早期腦損傷和腦血管痙攣[5]。近年來關于EBI的病理生理機制研究表明，SAH后發生的顱內壓升高、腦血管痙攣、腦缺血—再灌注損傷、有氧呼吸抑制、血腦屏障破壞、腦組織水腫以及神經元死亡共同導致了繼發性神經功能受損[5-6]，這為SAH后EBI進程提供了多個可能的干預靶點。Park等[7]發現，SAH后血管內皮細胞的凋亡可以增加血腦屏障的通透性，進而導致腦血管痙攣。Xi G等研究表明氧化應激在蛛網膜下腔出血后早期腦損傷的發生中具有重要作用，可歸因于血紅蛋白的大量釋放及鐵離子超負荷[8]。氧化應激反應可引起大量炎癥介質釋放，包括IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1等，炎癥級聯反應可以激活經線粒體途徑細胞凋亡通路的開放，多種細胞膜受體如TNFR、Fas、DR3-5由其相關配體激活，繼而活化Caspase前體蛋白，誘導細胞凋亡的發生。多個研究中心都可以檢測到SAH后線粒體途徑的Caspase-3活化[9]，所以抑制Caspase-3依賴的凋亡途徑可能有助于減輕大鼠蛛網膜下腔出血后早期腦損傷。

TPM又稱為妥泰，是近年來開發并用于臨床的一種新型抗癲癇藥，其化學結構為2，3，4，5-雙氧-1-甲基亞乙基-β-右旋-氨基硫磺吡喃果糖，即自然態單糖右旋果糖的硫化物。TPM的神經保護作用機制可能與以下方面有關：（1）抑制Na+、Ca2+通道的過度活化，減輕線粒體內Ca2+內流，因為神經細胞損傷后Ca2+內流可引起線粒體膜通透性增強進而釋放一些酶如細胞色素C等，引發一系列細胞凋亡的級聯反應，導致細胞凋亡。（2）抑制KA/AMPA型谷氨酸受體的作用，降低谷氨酸的興奮性毒性和氧化應激的損傷。（3）增強γ-氨基丁酸（GABA）系統介導的突觸抑制作用，防止神經細胞過度反應。Alves等[10]通過微透析技術檢查腦外傷病例發現，TPM可以通過血腦屏障，在腦組織達到相應濃度，降低腦組織Glu含量，并可作為一種神經營養因子，對膜蛋白復合體的磷酸化狀態進行調節，抑制腦組織內Ca2+內流，從而影響谷氨酸、GABA及AMPA等受體介導的神經元凋亡。研究者利用成年大鼠創傷性腦損傷模型研究發現：運用TPM治療可明顯提高腦損傷后的神經功能評分，縮小梗死體積，且治療結果與治療劑量呈正相關[11]。但目前TPM在蛛網膜下腔出血后早期腦損傷治療方面的應用尚缺乏相關研究。

本實驗結果顯示：SAH模型組大鼠的死亡率、腦水腫指數及凋亡細胞比例都明顯高于假手術組，而神經學評分低于假手術組，經TPM干預治療后，上述指標都有不同程度的改善。TPM還能下調Caspase-3相關凋亡蛋白表達，使促凋亡蛋白Bax表達減少而抑制凋亡蛋白Bcl-2表達增加，初步顯示TPM具有潛在的減輕SAH后神經元細胞凋亡的作用，且這種效應隨著給藥劑量的加大而逐漸增強。然而，本研究尚存在諸多不足：（1）實驗設計中缺乏陽性藥物對照組，難以凸顯TPM治療EBI的臨床價值及意義。（2）未觀察到TPM劑量的上限效應，因此，更合適的干預劑量需要進一步研究。（3）只選取了SAH后24h為評估時間點，未考慮藥物作用的時間效應關系。這些問題還有待進一步實驗研究。

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ObjectiveTo explore the neuroprotective effect of topiramate on brain injury in rats after experimental subarachnoid hemorrhage from the perspective of neuronal apoptosis，so as to provide theoretical basis for clinical application.MethodsForty healthy male SD rats were randomly divided into 5 groups：sham operation group（20 rats），SAH model group（30 rats）and SAH + TPM intervention group（90 rats were divided into 3 groups，2 hours after operation TPM 20mg/kg，40mg/kg and 80mg/kg intraperitoneal injection）. The model of mortality and neurobehavioral scores were made in each group at 24 h after model establishment. The brain edema index was measured by dry and wet weight method.TUNEL/NeuN/DAPI/Merge fl uorescence staining were used to observe the apoptosis of neurons. The expression of Caspase-3，Bcl-2 and Bax-related proteins was evaluated by Western blot.ResultsCompared with the sham group，the mortality and brain edema index of the SAH model group and each TPM intervention group was increased and the neurological score was decreased. Compared with SAH model group，the neurological scores of the three TPM intervention groups was increased and the brain edema index was decreased，the differences were statistically signi fi cant（P＜0.05）.After 24 hours of SAH，the expression of Caspase-3，Bcl-2 and Bax was up-regulated and the number of apoptotic cells were increased. After TPM intervention，the expression of Caspase-3 and pro-apoptotic protein Bax was decreased，the expression of Bcl-2 and the number of apoptotic cells were decreased，and the effect was positively correlated with the dose.ConclusionsTPM may promote the expression of Bcl-2 by inhibiting the expression of Caspase-3 and Bax，thereby reducing the secondary apoptosis of neurons after SAH，and has a positive effect on neurological function protection.

Topiramate Subarachnoid hemorrhage Early brain injury Apoptosis Apoptosis-related proteins

浙江中醫藥大學校級科研基金資助項目（2015ZY20）；浙江省教育廳一般科研項目資助項目（Y201636786）

310053 浙江中醫藥大學第二臨床醫學院（曹杰）310005 浙江中醫藥大學附屬第二醫院（范成普 杜杭根周冰之 王承 郝必烈）

*通信作者