位于細(xì)胞周期激酶抑制因子4 基因座中反義非編碼RNA 在慢性心力衰竭患者血清中的表達(dá)及臨床意義

費(fèi)民忠， 陳玲玲，張美玲，歐陽(yáng)平

臨床研究

位于細(xì)胞周期激酶抑制因子4 基因座中反義非編碼RNA 在慢性心力衰竭患者血清中的表達(dá)及臨床意義

費(fèi)民忠， 陳玲玲，張美玲，歐陽(yáng)平

心力衰竭是多種心臟疾病的終末階段，其治療效果欠佳且死亡率高。對(duì)其早期正確診斷和狀態(tài)評(píng)價(jià)有助于采用合理治療并可降低患者的死亡率[1]。盡管現(xiàn)在對(duì)于心力衰竭的診斷和治療方法已經(jīng)獲得巨大進(jìn)步，但其臨床遠(yuǎn)期預(yù)后效果卻不容樂觀[2，3]。如何及早的精確評(píng)估其心功能狀態(tài)以及發(fā)現(xiàn)影響慢性心力衰竭（CHF）發(fā)生發(fā)展及影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素，并早期給予正確的臨床干預(yù)措施，對(duì)改善心力衰竭的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及其臨床預(yù)后具有重要意義，怎樣能夠最大限度的提高患者的生存質(zhì)量及降低病死率就成為一個(gè)相對(duì)較為棘手的問題，且備受關(guān)注。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA，ANRIL）是一類位于細(xì)胞核內(nèi)或胞漿內(nèi)長(zhǎng)度超過200 nt 的功能性RNA分子，在真核細(xì)胞內(nèi)被普遍轉(zhuǎn)錄，但不具有或很少具有蛋白編碼功能[4]。與miRNA相比，LncRNA序列更長(zhǎng)，空間結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，所含的信息量更豐富，參與表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制更加多樣。近年的研究表明，LncRNA不但可以在多種層面上（ 表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等） 調(diào)控基因的表達(dá)，還參與了X 染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾以及核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程。

眾多研究結(jié)果提示在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，LncRNAs均有參與并發(fā)揮著重要作用[5-7]，然而LncRNAs在心血管系統(tǒng)疾病中的作用卻依然不十分清楚。前期通過基因芯片發(fā)現(xiàn)LncRNA ANRIL在CHF患者血清中明顯高于正常對(duì)照組，提示LncRNA ANRIL可能參與調(diào)節(jié)CHF的發(fā)生、發(fā)展。本研究旨在研究LncRNA ANRIL在CHF中的作用及意義。

1 資料與方法

研究對(duì)象：選擇2014-01至2016-01在我院心血管內(nèi)科收治臨床確診的冠心病CHF患者120例（CHF組），男性69例（55.8%），平均年齡（65.02±11.23）歲，按照紐約心臟協(xié)會(huì)（NYHA）評(píng)估心功能，即Ⅰ級(jí)28例，Ⅱ級(jí)34例，Ⅲ級(jí)35例，Ⅳ級(jí)23例；所有患者入院時(shí)檢測(cè)血漿內(nèi)胱抑素C水平。同期選擇健康者28例作為對(duì)照組，男15例，平均年齡（63.34±6.98）歲；入選標(biāo)準(zhǔn)：心電圖無異常，超聲心動(dòng)圖排除心臟結(jié)構(gòu)和心功能異常，并排除嚴(yán)重肝、腎功能不全、內(nèi)分泌疾病、嚴(yán)重先天性心臟病、心律失常和心臟瓣膜病、服用治療藥物、高血壓病史、糖尿病和缺血性心臟疾病等。

樣本收集：采集兩組受試者清晨空腹肘靜脈血5 ml，即刻用含抗凝劑的紫色采血管采集靜脈血靜置于4℃冷藏30 min后，室溫下3 000 rpm離心15 min，留取上層血清，置于-80℃冰箱備用。所有患者均簽署知情同意書， 經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

血清總RNA提取：將分離所得血清，置于冰上融化；取250μl血清樣品，加入750μl Trizol（Invitrogen， Grand Island，NY），振蕩器混勻，靜置 5 min；加入 200μl 氯仿，振蕩器混勻，靜置 10 min；室溫下離心 12 000 rpm、10 min，留取上清液并量取其體積，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)無核糖核酸酶的eppendorf （ EP） 管中；分別加入與上清液等體積的異丙醇，振蕩器振蕩混勻，室溫下靜置 3 min；室溫下離心 12 000 rpm、10 min；倒出管內(nèi)液體，加用1ml 75%乙醇；室溫 12 000 rpm 離心 2 min；倒出乙醇，并用Tip槍頭將剩余液體吸干凈，晾干。每管中加入 10μl 無 Rnase 的 去離子水（ddH2O），以能夠充分溶解 RNA；用分光光度計(jì)測(cè)定總 RNA 濃度及純度。

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR ）分析LncRNA ANRIL的表達(dá)水平：提取血清總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照逆轉(zhuǎn)錄酶（AMV） 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，在20μl體系中加2μg總RNA進(jìn)行cDNA 的合成。qRT-PCR采用2xSYBR Green PCR Master Mix（Takala，大連寶生生物，中國(guó)），取適量cDNA 作為模板，引物濃度 0.4μmol/L，15μl體系進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置3個(gè)平行樣，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)合成相應(yīng)上下游引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH ）作為內(nèi)參照。PCR 反應(yīng)在定量 PCR 反應(yīng)儀上進(jìn)行。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式 RQ=2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。

彩色多普勒超聲心動(dòng)圖（彩超）檢查：本組研究所選患者均在就診當(dāng)日或次日行超聲心動(dòng)圖檢查。采用PHILIPS IE33 型彩色超聲儀，S5-1 經(jīng)胸探頭，探頭融合頻率2.4MHz。患者取左側(cè)臥位，經(jīng)胸骨旁長(zhǎng)軸切面測(cè)量心臟內(nèi)各結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，主要包括左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVDs）、右心室內(nèi)徑（RVD）、室間隔壁厚度（SWTd）、左心室后壁壁厚度（PWTd）、左心房?jī)?nèi)徑（LAD）。所有測(cè)量都在不同掃查中重復(fù)3次。為避免彩超診斷結(jié)果存在誤差，所有結(jié)果均由彩超室1名副主任醫(yī)師審閱診斷，并由1名主任醫(yī)師復(fù)核，最后由1名主治醫(yī)師填寫彩超診斷報(bào)告單。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析： 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。血液標(biāo)本中LncRNA ANRIL及胱抑素C的表達(dá)差異采用t檢驗(yàn)分析，用 ±s表示；LncRNA ANRIL與胱抑素C的相關(guān)性分析采用線性回歸法，LncRNA ANRIL與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系使用Chi-Square檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組受試者一般臨床資料的比較（表1）：兩組受試者一般臨床資料比較， 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 兩組受試者一般臨床資料比較（ ±s）

兩組受試者及CHF組心功能不同等級(jí)患者血清LncRNA ANRIL與胱抑素C的表達(dá)（表2）：CHF組與對(duì)照組比較，血清LncRNA ANRIL（6.470±0.880 vs 1.760±0.850）及胱抑素C（6.950±1.250 vs 1.060±0.50）的表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.70；t=31.54，P均 ＜0.001）；CHF 組心 功 能 Ⅰ級(jí)～Ⅳ級(jí)的CHF患者，LncRNA ANRIL及胱抑素C的表達(dá)水平隨心功能的降低而逐漸升高，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 慢性心力衰竭組心功能不同等級(jí)患者血清中LncRNA ANRIL及胱抑素C的表達(dá)（ ±s）

CHF組患者血清中LncRNA ANRIL與胱抑素C的表達(dá)的相關(guān)性分析（圖1）：線性相關(guān)分析結(jié)果顯示，LncRNA ANRIL與胱抑素C的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.873，P＜0.001）。

兩組受試者及CHF組心功能不同等級(jí)患者間血清中LncRNA ANRIL的表達(dá)及與左心室射血分?jǐn)?shù)關(guān)系（表3）：兩組受試者與CHF組心功能不同等級(jí)患者血清LncRNA ANRIL水平、LVEDD隨著心功能的降低而增大， 左心室射血分?jǐn)?shù)的則隨著心功能的降低而升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

圖1 血清LncRNA ANRIL的表達(dá)與胱抑素C的相關(guān)性

表3 兩組受試者及CHF組心功能不同等級(jí)患者血清中LncRNA ANRIL的表達(dá)及與左心室射血分?jǐn)?shù)關(guān)系（ ±s）

3 討論

心力衰竭是一種由各類心臟病導(dǎo)致心功能不全的臨床綜合征，是最嚴(yán)重的心臟病。近期由于人口老齡化的加重以及高血壓等疾病的流行，心力衰竭的患病率也隨之升高，成為目前最重要的心血管疾病[8]。而心力衰竭最常見的病因是冠心病和高血壓，在我國(guó)，冠心病導(dǎo)致的心力衰竭由1980年的36.8%上升至2000年的45.6%，在各種病因中居于首位[9]。LncRNA是一類位于細(xì)胞核內(nèi)或胞漿內(nèi)長(zhǎng)度超過200 n的功能性RNA分子，在真核細(xì)胞內(nèi)被普遍轉(zhuǎn)錄，但不具有或很少具有蛋白編碼功能。近年來，LncRNA與復(fù)雜疾病發(fā)生之間的關(guān)系備受關(guān)注，人們對(duì)LncRNA在細(xì)胞生物學(xué)中的功能模式展開了一系列研究。最近研究表明，LncRNA的異常表達(dá)與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[10，11]。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)PHB2的失活，從而維持PHB2正常水平，抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞。Wang等[13]為探討心肌細(xì)胞肥大中miRNA和LncRNA的作用，使用血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）對(duì)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞中miR-489表達(dá)量明顯減少。使用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)心肌細(xì)胞中miR-489的表達(dá)量可拮抗Ang Ⅱ?qū)е碌募?xì)胞肥大損傷；進(jìn)一步探索其中的分子機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，LncRNA心臟肥大相關(guān)因素（CHRF）可作為miR-489的“內(nèi)源性海綿”，下調(diào)miR-489的表達(dá)水平，從而對(duì)miR-489的靶基因Myd88進(jìn)行調(diào)控，影響心肌細(xì)胞肥大。Leung等[14]為研究AngⅡ?qū)蜣D(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的影響，使用AngⅡ干預(yù)體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞增殖的miR-221和miR-222 轉(zhuǎn)錄自LncRNA Ang362，敲除Ang362后miR-221和miR-222表達(dá)下降，血管平滑肌細(xì)胞增殖降低。ANRIL是人染色體9p21上的一個(gè)重要LncRNA，位于INK4基因座，并可對(duì)p14、p15和p16的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行負(fù)調(diào)控[15]。全基因組關(guān)聯(lián)研究（ genome-wide association study，GWAS）發(fā)現(xiàn)，LncRNA ANRIL基因所在的9p21染色體區(qū)域是一個(gè)重要的冠心病易感區(qū)域，并且相繼在不同的研究人群中得到印證[16]。血管平滑肌細(xì)胞（VSMC） 在動(dòng)脈粥樣斑塊形成過程中發(fā)揮了重要的作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，ANRIL的變異可以影響VSMC內(nèi)p15和p16的表達(dá)，從而影響VSMC的增殖和冠心病的發(fā)生[17]。然而LncRNA ANRIL在冠心病CHF患者血清中的表達(dá)及其意義，目前國(guó)內(nèi)外尚少見相關(guān)報(bào)道。

本研究通過qRT-PCR檢測(cè)我院收治的120例CHF患者及28例正常對(duì)照者血清LncRNA ANRIL及胱抑素C的表達(dá)，分析LncRNA ANRIL的表達(dá)與胱抑素及左心室射血分?jǐn)?shù)的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，CHF組患者血清LncRNA ANRIL及胱抑素C的表達(dá)水平明顯增高；心功能Ⅰ級(jí)～Ⅳ級(jí)的CHF患者中，LncRNA ANRIL的表達(dá)水平逐漸升高；相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)血清LncRNA ANRIL與胱抑素C的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系；血清LncRNA ANRIL水平隨著LVEDD的增大而升高，隨著左心室射血分?jǐn)?shù)的降低而升高。以上研究結(jié)果提示血清LncRNA ANRIL水平的高低與CHF具有一定的相關(guān)性，可以間接的反映心力衰竭的嚴(yán)重程度。該研究為尋找潛在的冠心病CHF診斷及預(yù)后標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

[1] Fu TC, Lin YC, Chang CM, et al. Validation of a new simple scale to measure symptoms in heart failure from traditional Chinese medicine view: a cross-sectional questionnaire study. BMC Complement Altern Med, 2016, 16: 342.

[2] 張健, 王運(yùn)紅. 心力衰竭藥物治療的新進(jìn)展. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2016,31: 36-38.

[3] Nobre TS, Antunes-Correa LM, Groehs RV, et al. Exercise training improves neurovascular control and calcium cycling gene expression in heart failure patients with cardiac resynchronization therapy. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2016, 311: H1180-H1188. .

[4] Busch A, Eken SM, Maegdefessel L. Prospective and therapeutic screening value of non-coding RNA as biomarkers in cardiovascular disease. Ann Transl Med, 2016: 4, 236.

[5] El Azzouzi H, Doevendans PA, Sluijter JP. Long non-coding RNAs in heart failure: an obvious lnc. Ann Transl Med, 2016, 4: 182.

[6] Gast M, Schroen B, Voigt A, et al. Long noncoding RNA MALAT1-derived mascRNA is involved in cardiovascular innate immunity. J Mol Cell Biol, 2016, 8: 178-181.

[7] Greco S, Zaccagnini G, Perfetti A, et al. Long noncoding RNA dysregulation in ischemic heart failure. J Transl Med, 2016, 14: 183.

[8] Oh J, Kang SM, Kim IC, et al. The beneficial prognostic value of hemoconcentration is negatively affected by hyponatremia in acute decompensated heart failure: Data from the Korean Heart Failure(KorHF) Registry. J Cardiol. 2017 , 69: 790-796.

[9] 孫路路, 呂蓉, 梁濤, 等. 心力衰竭患者出院后1年內(nèi)預(yù)后狀況及影響因素分析. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2013, 28: 18-20.

[10] Peters T, Hermans-Beijnsberger S, Beqqali A, et al. Long non-coding RNA malat-1 is dispensable during pressure overload-induced cardiac remodeling and failure in Mice. PLoS One, 2016, 11: e0150236.

[11] Viereck J, Kumarswamy R, Foinquinos A, et al. Long noncoding RNA Chast promotes cardiac remodeling. Sci Transl Med, 2016 , 17;8:326ra22.

[12] Wang K, Long B, Zhou LY, et al. CARL lncRNA inhibits anoxiainduced mitochondrial fission and apoptosis in cardiomyocytes by impairing miR-539-dependent PHB2 downregulation. Nat Commun,2014 , 5: 3596.

[13] Wang K, Liu F, Zhou LY, et al. The long noncoding RNA CHRF regulates cardiac hypertrophy by targeting miR-489. Circ Res, 2014,114: 1377-1388.

[14] Leung A, Trac C, Jin W, et al. Novel long noncoding RNAs are regulated by angiotensin II in vascular smooth muscle cells. Circ Res,2013, 113: 266-278.

[15] Qiu JJ, Lin YY, Ding JX, et al. Long non-coding RNA ANRIL predicts poor prognosis and promotes invasion/metastasis in serous ovarian cancer. Int J Oncol, 2015, 46: 2497-2505.

[16] Pasmant E, Sabbagh A, Vidaud M, et al. ANRIL, a long, noncoding RNA, is an unexpected major hotspot in GWAS. Faseb J, 2011, 25:444-448.

[17] Zhuang J, Peng W, Li H, et al. Methylation of p15INK4b and expression of ANRIL on chromosome 9p21 are associated with coronary artery disease. PLoS One, 2012, 7: e47193.

2016-11-25）

（編輯：曹洪紅）

Expression and Clinical Significance of Serum Long Chain Non-encoded RNA ANRIL in Chronic Heart Failure Patients

FEI Min-zhong, CHEN Ling-ling, ZHANG Mei-ling, OUYANG Ping.

Department of Cardiology, Central Hospital of Songjiang District, Shanghai (201600), China

OUYANG Ping, Email: ouyangpping@126.com

Objective: To explore the expression and clinical signif i cance of serum long chain non-encoded RNA ANRIL (LncRNA ANRIL) in chronic heart failure (CHF) patients.

Methods: Our research included in 2 groups: CHF group, n=120 patients treated in our hospital and Control group,n=28 healthy subjects at the same period of time. Based on NYHA classif i cation, CHF patients were further divided into 4 subgroups: NYHA Ⅰ subgroup, n=28, NYHA II subgroup, n=34, NYHA Ⅲ subgroup, n=35 and NYHA Ⅳ subgroup, n=23.Expressions of serum ANRIL and cystatin C were examined by real time fluorescence quantitative PCR (QRT-PCR) and compared between 2 groups; the relationship between ANRIL, cystatin C and cardiac function were studied.

Results: Compared with Control group, CHF group had increased serum levels of ANRIL and cystatin C, P＜0.05.ANRIL expression was gradually increasing by cardiac function decreasing in CHF I to CHFⅣsubgroups, P＜0.05.Correlation analysis found that serum level of ANRIL was positively related to cystatin C (r=0.873, P＜0.001). ANRIL was elevated by increased left ventricular end diastolic diameter and decreased ejection fraction, both P＜0.05.

Conclusion: Serum ANRIL level has been related to CHF at certain degree which may indirectly ref l ect the severity of HF in relevant patients.

Gene expression; Heart failure

目的：探討檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼位于細(xì)胞周期激酶抑制因子4（INK4） 基因座中反義非編碼RNA（LncRNA ANRIL）在慢性心力衰竭(CHF)患者血清中的表達(dá)及臨床意義。

方法：選擇我院收治的冠心病CHF患者（CHF組）120例，按美國(guó)紐約心臟協(xié)會(huì)（NYHA）評(píng)價(jià)心功能，即Ⅰ級(jí)28例、Ⅱ級(jí)34例、Ⅲ級(jí)35例、Ⅳ級(jí)23例；收集同期健康體檢者28例作為對(duì)照組，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)兩組血清LncRNA ANRIL及胱抑素C的表達(dá),分析血清LncRNA ANRIL的表達(dá)與胱抑素及左心室射血分?jǐn)?shù)的相關(guān)性。

結(jié)果：與對(duì)照組比較，CHF患者血清LncRNA ANRIL及胱抑素C的表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。心功能Ⅰ級(jí)～Ⅳ級(jí)的CHF患者中，血清LncRNA ANRIL的表達(dá)水平隨心功能的降低而逐漸升高，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)血清LncRNA ANRIL與胱抑素C的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.873，P＜0.001）。血清LncRNA ANRIL水平隨著左心室舒張末期內(nèi)徑的增大而升高，隨著左心室射血分?jǐn)?shù)的降低而升高，兩者之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

結(jié)論：血清LncRNA ANRIL水平的高低與CHF具有一定的相關(guān)性，可以間接的反映心力衰竭的嚴(yán)重程度。

基因表達(dá)；心力衰竭

201600 上海市，上海市松江區(qū)中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科

費(fèi)民忠 主治醫(yī)師 碩士 主要從事心血管及心臟介入治療方面研究 Email：feimz@sina.com 通訊作者：歐陽(yáng)平Email：ouyangpping@126.com

R541

A

1000-3614（2017）11-1095-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.11.012

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1095.)