FTO基因多態性及其與2個綿羊群體生長性狀的相關性

康曉龍，張莉莉，王昊升，毛 浩，楊 潤，馮登偵

(寧夏大學農學院 動物科學系，寧夏 銀川 750021)

FTO基因多態性及其與2個綿羊群體生長性狀的相關性

康曉龍，張莉莉，王昊升，毛 浩，楊 潤，馮登偵

(寧夏大學農學院 動物科學系，寧夏 銀川 750021)

【目的】本文探討了FTO基因多態性與不同綿羊群體生長性狀的相關性。【方法】采用飛行質譜技術檢測了FTO基因在杜泊羊和灘寒雜交群體中的多態性及其與生長性狀的相關性。【結果】FTO基因的rs160915957位點的AA基因型個體體重在杜泊和灘寒綿羊群體中分別為極顯著(Plt;0.01)和顯著(Plt;0.05)低于GG型個體。GG型綿羊胸圍最大，且GG型杜泊羊胸圍顯著大于灘寒羊GG型個體(Plt;0.05)。GG型個體在2個群體中的體斜長最大，同一群體不同基因型間差異不顯著(Pgt;0.05)；不同基因型間，灘寒群體綿羊體高大于杜泊羊，但只有AA型個體在2個群體間顯著差異(Plt;0.05)。此外，GG型個體的杜泊羊胸寬最大，AA型的最小，這與灘寒群體相反，但均沒有顯著性差異(Pgt;0.05)。FTO基因的rs160915957位點不同基因型對綿羊其他性狀的影響差異不顯著。【結論】FTO基因的rs160915957位點對杜泊及灘寒綿羊群體的體重、體斜長及胸圍等具有顯著影響。FTO基因是否是影響綿羊生長性狀的主效基因尚待進一步探討，但FTO基因的rs160915957位點多態性將為不同綿羊群體后代的體重、胸圍等性狀的選擇提供參考依據。

脂肪和肥胖相關基因；FTO基因；生長性狀；杜泊羊；灘寒雜交群體

【研究意義】脂肪和肥胖相關基因(fat mass and obesity associated gene，FTO)是首次利用全基因組關聯研究(genome wide association study，GWAS)被證實與肥胖相關的可靠候選基因。FTO普遍表達于動物機體的各個組織[1]。FTO基因的遺傳多態是否與綿羊群體的生長發育性狀具有相關性,值得探討。【前人研究進展】相關研究證實FTO基因的變異位點可影響人類的體質指數，與體重及脂肪含量的增加以及攝食行為的改變有關[2-4]。FTO基因的單核苷酸多態性不僅參與人類肥胖調控，與人糖尿病及胰島素抵抗密切相關[5]；FTO同樣介導家養動物，如家豬的肌內脂肪含量、背膘厚及瘦肉率的變化[6-7]。FTO基因可作為C/EBP家族的轉錄輔助活化因子促進未甲基化和受甲基化抑制的基因啟動子轉錄[8-9]，參與動物機體脂肪細胞的分化及脂質代謝。此外，FTO基因還在動物β細胞功能調節[10]及氧化應激[11]等生物學過程中發揮調控功能。由于不能作為理想的肥胖動物模型，有關綿羊FTO基因的分子結構與生物學調控功能報道不多，NCBI上僅見綿羊FTO的預測序列。【本研究切入點】依據FTO基因在人類個體肥胖及家豬體重差異中的研究結果，本研究主要針對FTO基因多態性與不同群體綿羊生長性狀進行相關性分析。【擬解決的關鍵問題】為后期綿羊雜交選育及生產養殖提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗選用寧夏宇泊科技有限公司186只，3～4歲的綿羊作為研究對象，其中杜泊羊(DB)26只，灘寒雜交羊(TH ，F1代)160只。所選綿羊群體均健康無病且飼養管理條件一致。頸靜脈采血5 mL，輕微振蕩后于-20 ℃保存。綿羊體尺性狀測定方法如下：體高：綿羊鬐胛最高點至地面垂直距離；體斜長：肩胛骨前緣至坐骨結節后緣的直線距離；管圍：左前肢管部上三分之一處的周長；腰角寬：兩側腰角外緣間的直線距離；胸圍：肩胛后端繞胸一周的長度；胸寬：兩側肩胛骨后緣最寬點的直線距離；胸深：鬐胛最高點到胸骨底面的距離。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用哺乳動物血液DNA提取試劑盒(天根)提取綿羊基因組DNA，試驗步驟和方法參考其說明書，經濃度測定后，利用1 %的瓊脂糖凝膠電泳對分離DNA進行質量檢測。

1.2.2 群體基因型的Sequenom SNPs分析 飛行質譜分型檢測技術是一種可同時對多個位點進行檢測的新型SNP分型方法。該方法在引物延伸的基礎上，通過在待檢SNP位點上延伸若干堿基，根據延伸產物分子質量的不同，將僅含單個不同堿基的兩段序列區別開來，從而鑒定出不同基因型。

1.2.3 引物設計及PCR擴增 依據SNP位點序列，使用Sequenom公司的引物軟件(Assay design 3.1)設計反應所需引物并合成，引物序列見表1。PCR擴增反應體系如表2所示；PCR產物純化：10×SAP緩沖液0.23 μl，SAP酶0.4 μl，水2.1 μl；反應條件見表2。

1.2.4 延伸反應 反應體系：10× iPLEX buffer plus 1 μl；iPLEX terminator 0.27 μl；Primer Mix 1.1 μl；iPlex酶0.06 μl；水1.05 μl。擴增條件如表2所示。反應樣品經樹脂純化后，轉入Sequenom芯片上進行電離飛行時間質譜分析，收集數據，完成分型。

1.2.5 數據處理與統計分析 使用Excel統計各位點的基因頻率、基因型頻率；利用SPSS 22.0軟件對個體基因型與體尺表型進行相關性分析，以最小二乘均值±標準差表示。

基因效應方差分析模型：Y=μ+G+m+e

其中，Y為性狀測定值，μ為群體均值，G為基因型效應，m為性別效應，e為隨機殘差。

表1 Sequenom SNP FTO基因測序引物信息

表2 PCR反應條件

圖1 綿羊血液DNA凝膠電泳分析Fig.1 Gel electrophoresis analysis of DNA for sheep blood

A (橙色): AA型個體，GA(綠色): GA型個體，G (藍色): GG型個體A: The genotype of individuals in the orange region was AA; GA: The genotype of individuals in green region was GA; G: The genotype of individuals in blue region was GG圖2 綿羊FTO基因飛行質譜檢測Fig.2 Mass spectrometry results for FTO gene

位點Loci基因型Genotype基因型頻率Genotypefrequency等位基因Allele等位基因頻率AllelicfrequencyDBTHDBTHDBTHDBTHrs160915957AA(9)AA(21)0.3460.130AA0.550.36GA(10)GA(56)0.3850.350GG0.450.64GG(7)GG(81)0.2690.510rs160915959CC(26)CC(158)11rs160916105TT(26)TT(158)11rs160916113CC(26)CC(158)11rs160915950AA(26)AA(158)11rs160915958TT(26)TT(157)10.981TC(1)0.006rs160916114CC(26)CC(157)10.994CT(1)0.006

2 結果與分析

2.1 血液DNA提取

通過對綿羊186個個體血液DNA提取及質量檢測，所有樣品質量均合格(圖1)。實驗測定的DNA濃度在1.8～2.1，單個樣品濃度gt;20 ng/μl，單個樣品實驗總量gt;1 μg，樣品無大分子污染，樣品保持完整，無降解；可用于后續實驗。

2.2 試驗群體FTO基因質譜分型

經Sequenom SNP測序分析，FTO基因不同位點均能檢出相關基因型，檢出率為98.92 %，未檢出個體占1.08 %。除rs160915957位點外，其余位點均檢測到1中基因型(圖2)，其中rs160915958與rs160916114位點無統計學意義，不作進一步分析。

2.3 FTO基因檢測位點的遺傳多態性分析

由表3分析顯示，在DB群體中，AA基因型占34.6 %，GA基因型為38.5 %，GG基因型為26.9 %，A為優勢等位基因；而在TH群體中，GG基因占51.3 %，GA基因型為35.4 %，AA基因型為13.3 %，G為優勢等位基因。

FTO基因是一個在不同物種間早已報道的基因，其在NCBI數據庫rs160915957位點，即綿羊14號染色體21594213堿基處(第一外顯子7795bp)，有一A→G的錯義突變，并導致相應的氨基酸由蛋氨酸Met突變為纈氨酸Val(圖3)。本實驗測序結果顯示，FTO基因rs160915957位點在2個綿羊群體中分別有3種基因型，AA，GA，GG型。其中，在DB群體中，A和G等位基因頻率分別為0.55和0.45；在TH群體中，A和G等位基因頻率分別為0.36和0.64。

2.4 FTO基因測定位點與生產性狀的相關性分析

針對FTO基因rs160915957位點與DB和TH綿羊群體主要生長性狀的相關性分析表明，AA基因型個體在兩個綿羊群體中的體重最小，而GG型個體的體重最大(表4)；DB群體中，不同基因型間的個體體重差異極顯著(Plt;0.01)，而TH群體中，除AA型個體體重顯著小于GG型個體外，其余無顯著差異。不同基因型間，TH群體綿羊體高大于DB群體，但只有AA型個體在兩個群體間顯著差異(Plt;0.05)。2個群體中，GG型綿羊胸圍最大，其中DB群體GG型個體顯著高于雜合子個體，且DB個體胸圍顯著大于TH綿羊個體；對于該位點與綿羊胸寬性狀的相關性分析，兩個群體具有差異，在DB群體中GG型個體胸寬最大，而AA型最小；而在TH群體中，則為AA型個體胸寬最大，GG型個體最小，但在統計學上沒有顯著性差異。同時，GG型個體在2個群體中的體斜長表型中最大，2個群體中不同基因型間無顯著差異，但TH群體AA型個體的體斜長顯著低于DB各基因型個體。此外，在2個群體綿羊的腰角寬表型中，雜合子個體低于其他基因型，但不具有統計學意義(Pgt;0.05)。

圖3 綿羊FTO基因rs160915957位點信息Fig.3 Location information for rs160915957 loci of sheep FTO

品種Breeds基因型Genotype生長性狀(Mean±S.D.)Growthtraits體重(kg)Bodyweight體高(cm)Bodyheight體斜長(cm)Bodylength胸圍(cm)Chestgirth胸深(cm)Chestdepth胸寬(cm)Chestwidth管圍(cm)Shincircumference腰角寬(cm)HipwidthDBAA51.92±4.45A64.50±4.06a67.19±4.37b91.36±3.90a33.45±3.2621.93±3.629.18±1.7321.09±2.08GA62.23±3.73B65.15±3.37ac66.28±3.39b91.99±2.43a33.90±3.6424.39±3.158.56±1.3417.64±3.87GG75.50±4.45C65.58±5.32ac68.68±3.76b97.43±2.13b33.80±3.9126.08±2.9710.38±1.7418.48±2.64THAA37.98±3.31Da70.75±3.71b61.03±2.86a86.68±3.55ad35.27±3.5523.32±2.298.17±1.4018.10±3.41GA40.44±3.32Dab68.96±4.59ab64.46±4.14ab84.80±4.41dc33.99±3.6921.80±3.159.28±2.1317.68±1.95GG42.83±4.37Db69.82±4.04bc65.38±3.17ab87.11±3.32ad33.68±4.3821.63±4.388.61±1.5418.26±2.37

注：同列標有不同大寫字母表示差異極顯著(Plt;0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(Plt;0.05)。

Note: Data with a different superscript capital letters in one column was significant at 0.01 level, and small letters at 0.05 level.

3 討 論

FTO基因是最早報道與哺乳動物肥胖相關的等位基因。人及模式生物小鼠方面的FTO研究主要集中于位點多態與食物攝入及肥胖疾病之間的相關性，從而為預防人類肥胖提供參考。如FTO基因rs9939609位點突變與我國成年人肥胖之間具有顯著的相關性[12]。隨著對FTO基因研究的不斷深入，關于FTO基因與畜禽生長發育、脂肪沉積及肉品質相關的報道也逐漸增多。以牛為試驗動物的研究結果表明，FTO基因核苷酸多態性影響雜交牛的生長體重和平均日增重[13]。同時FTO基因單核苷酸多態性不僅影響豬的平均日增重[14]，豬FTO基因g.276Tgt;G位點多態與其脂肪特征、大理石紋、背部脂肪厚度和肌內脂肪含量密切相關[15]。家兔FTO基因的c. 499Ggt;A位點顯著影響35、70和84日齡新西蘭兔的體重；其中c.660Tgt;C位點的CC基因型顯著影響84日齡新西蘭兔的體重、平均日增重及肌內脂肪含量[16]。

在綿羊研究中，已有的報道主要集中于FTO基因的組織時空表達差異及其多態性與綿羊脂肪沉積的相關性分析[17-18]。針對杜泊羊(DB)及與灘寒(TH)雜交羊的生長體尺差異，本試驗選擇FTO基因多個位點與兩個群體綿羊的生長性狀進行遺傳相關性檢測。通過飛行質譜分型技術對FTO基因7個位點的遺傳分析，除rs160915957位點外，其余6個位點只檢測出一種或無統計學意義的基因型，提示rs160915957位點與試驗綿羊群體的生長發育具有一定的相關性。本研究中，不論是杜泊群體(DB)或灘寒雜交群體(TH)，rs160915957位點的GG基因型個體在體重方面顯著高于其他基因型個體。研究表明，杜泊羊在1、2、3及4月齡的平均日增重均顯著高于我國本土綿羊[19]。結合本試驗結果，FTO基因可能與杜泊羊及灘寒雜交羊的體重具有顯著的相關性。由于TH群體具有小尾寒羊血統，TH羊AA基因型個體體高顯著高于DB羊。2個群體中，GG型個體胸圍最大，同一群體不同基因型間無顯著差異，但DB群體不同基因型個體胸圍均高于TH群體各基因型，可能是由于品種間本身的遺傳差異所致。此外，無論同一群體不同基因型間或同一基因型中的不同群體，胸深、胸寬、管圍及腰角寬均無顯著差異，提示FTO基因的rs160915957位點與上述表型性狀相關性較小。

除了單核苷酸變異外，基因的表達差異也可能會導致動物個體的體重及體尺差異。FTO基因在綿羊多個部位均有表達，但脂肪與下丘腦之間FTO基因表達存在顯著差異[17]，這與在人類方面的報道吻合[20]。下丘腦是能量調節的中樞，禁食48 h大鼠的FTO基因的表達與下丘腦正向調節存在正相關；FTO表達水平與弓狀核中促進食欲的促生長激素神經肽類似肽的表達存在顯著負相關[21]。FTO基因表達位點不僅存在促食欲肽類，如β-內啡肽和NPY等，也存在抑制食欲的肽類，如α-MSH。因此，FTO基因對機體體重、生長發育的調節可能通過介導動物采食中樞過程發揮作用。通過對妊娠綿羊分別給予充足食物或者從妊娠早期至中期只給予半量食物供給的研究表明，在妊娠110 d時，綿羊胎盤中FTO基因表達量與胎羊的體重存在顯著正相關[22]。因此，FTO基因可能通過對采食中樞—下丘腦的調節，參與綿羊采食行為調控，引起生長體尺性狀差異。

早期的FTO研究主要針對位點多態與動物體重增加、能量平衡調控、脂肪沉積及肥胖相關性開展研究。FTO基因位點變異是否參與綿羊群體生長差異的主要基因，報道較少。本研究結果中，FTO基因rs160915957位點與2個綿羊群體的體重、體高、體斜長及胸圍方面具有相關性，提示除了與肉質性狀及脂肪沉積與肥胖相關外，FTO基因與綿羊的體格大小及生長發育亦具有相關性。杜灘寒三元雜交羔羊在日增重和屠宰性能方面均極顯著高于灘寒雜交羔羊(Plt;0.01)[23]。因此，以杜泊羊做終端父本與灘寒雜交羊群體進行三元經濟雜交可能具有較高的生長潛力與屠宰性能。

4 結 論

由本研究結果可知，FTO基因的rs160915957位點可作為杜泊羊及灘寒雜交羊標記輔助育種的候選位點，可對后續雜交育種中綿羊的體重、體高、體斜長及胸圍性狀的選擇提供依據。然而由于樣本量及基因位點數量的限制，后續研究可在擴大樣本量及分析FTO基因其他SNPs位點的基礎上，明確FTO基因與綿羊主要生長性狀的相關性；而從表達水平研究FTO基因的表達差異及其對綿羊生長性狀的分子調控也將為綿羊FTO基因的生物學功能研究奠定基礎。

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(責任編輯 陳 虹)

AssociationofFTOGeneGeneticVariationwithGrowthTraitsofTwoSheepPopulation

KANG Xiao-long, ZHANG Li-li, WANG Hao-sheng, MAO Hao, YANG Run, FENG Deng-zhen

(School of Agriculture, Ningxia University, Ningxia Yinchuan 750021, China)

【Objective】In this paper, the association betweenFTOgene polymorphism and the growth traits of two sheep populations were investigated.【Method】The polymorphisms ofFTOgene in Dorper and Tan×Han hybrid sheep and their correlation with growth traits by sequenom SNP technology were investigated. 【Result】The body weight of AA genotype at the rs160915957 locus of theFTOgene was significantly different (Plt;0.01) and significantly lower (Plt;0.05) than that of the GG type in two sheep. GG type sheep had the largest bust value, and the chest girth of GG individuals in Doper sheep was larger than that of Tan×Han sheep. The body length of GG individuals was the largest in both sheep groups, but there was no significant difference among genotypes in same group (Pgt;0.05); The body height of TH sheep was higher than that of DB sheep among three genotypes, but only AA group had significant difference between the two groups (Plt;0.05). In addition, GG individuals had the largest breast width while AA type were the lowest one, which was contrary to Tan×Han group (Pgt;0.05). There were no significant differences of rs160915957 locus ofFTOgene in other growth traits of sheep. 【Conclusion】The above results demonstrated that the rs160915957 locus ofFTOgene had a significant effect on the body weight, length, height and chest girth of two sheep population，whether theFTOgene was the major gene affecting the growth traits of sheep remained to be further explored, but the rs160915957 polymorphism ofFTOgene would provide a reference for traits selection in different sheep offsprings.

Fat mass and obesity associated gene;FTOgene; Growth traits; Dorper sheep; Tan×Han hybrid sheep

S826

A

1001-4829(2017)11-2603-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.11.036

2017-05-20

寧夏自然科學基金(NZ15030)

康曉龍(1982-)，男，回族，副教授，博士，主要從事動物分子遺傳育種研究，E-mail：kangxl@nxu.edu.cn。