兒童患者中分離350株流感嗜血桿菌的分布和耐藥性分析

甄 楊 ，宋文琪，董 方，鄭紅艷，甄景慧

兒童患者中分離350株流感嗜血桿菌的分布和耐藥性分析

甄 楊 ，宋文琪，董 方，鄭紅艷，甄景慧

目的研究兒童流感嗜血桿菌臨床分布及耐藥性，指導臨床合理用藥。方法對2014－2015年北京兒童醫院住院患兒臨床送檢標本分離出350株流感嗜血桿菌的分布、產β內酰胺酶情況和藥敏結果進行回顧性分析。藥敏試驗采用紙片擴散法，頭孢硝噻吩紙片法測定β內酰胺酶，按照臨床和實驗室標準化協會（CLSI）2014年的標準進行藥敏檢測和結果判斷。使用WHONET 5.6和SPSS15.0軟件進行數據統計分析。結果流感嗜血桿菌感染多見于嬰幼兒，常見合并其他病原感染。β內酰胺酶陽性率為53.1% ，對甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率最高，為76.9%，對環丙沙星、頭孢唑肟、氯霉素、四環素、阿莫西林-克拉維酸、頭孢呋辛、阿奇霉素、頭孢克洛、氨芐西林敏感率分別為99.1%、98.9%、95.4%、88.3%、87.7%、74.9%、65.4%、56.6%、46.0%，未檢出對頭孢曲松、美羅培南不敏感的流感嗜血桿菌。結論兒童分離的流感嗜血桿菌產 β 內酰胺酶陽性率很高，是流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥的主要機制，其高產酶特點使氨芐西林不能作為臨床一線用藥。流感嗜血桿菌對甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率最高，對β內酰胺類以外抗菌藥物，最敏感的是環丙沙星，其次為氯霉素。

兒童； 流感嗜血桿菌； β內酰胺酶； 耐藥性

流感嗜血桿菌是一種只侵犯人類的革蘭陰性桿菌，是兒童呼吸道感染常見的病原菌，可引起多個器官的感染，引起肺炎、腦膜炎、蜂窩組織炎、關節炎及敗血癥等疾病，嚴重影響兒童的健康。青霉素類、頭孢菌素類及大環內酯類抗生素是治療兒童呼吸道感染的主要經驗性用藥，隨著臨床抗生素的廣泛應用，流感嗜血桿菌的耐藥菌株日益增多，給臨床治療帶來很大困難。本研究對2014－2015年臨床住院患兒中分離的350株流感嗜血桿菌進行回顧性調查研究，以期為臨床合理應用抗菌藥物提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源 350株流感嗜血桿菌分離自2014年11月1日－2015年10月31日北京兒童醫院細菌室住院患兒的各種標本，剔除同一患兒相同部位的重復菌株。

1.1.2培養基來源 分離用嗜血桿菌巧克力平皿購自法國生物梅里埃公司，藥敏HTM培養基干粉購自英國OXOID公司，由本室自行配制并施行嚴格的質量控制。

1.1.3鑒定和藥敏紙片來源 鑒定用的V因子、X因子、X+V因子和用于測定β內酰胺酶檢測的頭孢硝噻吩試劑（Nitrocefin紙片）購自英國OXOID公司。藥敏試驗選用12種抗菌藥物紙片：氨芐西林（10 μg）、阿莫西林-克拉維酸 （30 μg）、頭孢呋辛（30 μg）、頭孢曲松（30 μg）、頭孢唑肟（30 μg）、頭孢克洛（30 μg）、美羅培南（10 μg）、環丙沙星（5 μg）、甲氧芐啶-磺胺甲唑 （25 μg）、阿奇霉素（15 μg）、氯霉素（30 μg）、四環素（30 μg）均購自英國OXOID公司。

1.2 方法

1.2.1標本來源 來自于臨床住院患兒送檢的各種標本，其中呼吸道標本中的痰標本先進行涂片鏡檢，每個低倍鏡視野內鱗狀上皮細胞少于10個，白細胞多于25個，視為合格樣本。

1.2.2細菌培養及鑒定 按規程進行操作，將各種標本以劃線分離法分別接種于血平皿和巧克力平皿，5% CO2孵箱35 ℃ 培養18～24 h。自巧克力平皿挑取呈無色、透明、表面光滑、邊緣整齊、似露滴狀、濕潤可疑菌落，革蘭染色可見陰性小短桿菌，配0.5麥氏濁度菌液接種于營養瓊脂平皿上，貼V、X、X+V因子3種生長因子，35 ℃ 孵育24 h，X+V因子陽性，V因子和X因子均為陰性的鑒定為流感嗜血桿菌。

1.2.3藥敏試驗 根據2014年CLSI標準進行藥敏試驗和結果判定[1]，使用紙片擴散法，對12種抗菌藥物進行藥敏試驗。β內酰胺酶測定用頭孢硝噻吩紙片，10 min內變紅表示β內酰胺酶陽性，不變色為陰性。

1.2.4質控菌株 流感嗜血桿菌ATCC49247和流感嗜血桿菌ATCC49619。

1.2.5統計分析 采用WHONET 5.6和SPSS15.0軟件進行數據處理和統計分析。

2 結果

2.1 菌株分布

2.1.1年齡分布 350株流感嗜血桿菌中，患兒年齡為1個月～17歲， 其中男241例，女109例。1個月～＜1歲占62.0%（217/350），1～3歲占16.6%（58/350），4～＜6歲占12.3%（43/350），6～17歲占9.1%（32/350）。

2.1.2病區分布 內科病房占82.9%（290/350）；重癥監護病房（PICU）占9.4%（33/350），耳鼻喉科病房占2.9%（10/350）、皮膚科病房占2.9%（10/350）、外科病房占2.0%（7/350）。

2.1.3標本來源 350株流感嗜血桿菌來源于呼吸道分泌物標本98.3%（344/350），眼分泌物1.1%（4/350），陰道分泌物0.3%（1/350），口周分泌物0.3%（1/350）。呼吸道分泌物中下呼吸道分泌物為主89.4%（313/350），包括痰70.9%（248/350），支氣管肺泡灌洗液18.6%（65/350）；上呼吸道分泌物8.9%（31/350），包括咽拭子7.4%（26/350），鼻咽分泌物1.4%（5/350）。

2.2 復數菌分離情況

在350例分離出流感嗜血桿菌的的患兒中，分離出復數菌占21.7%（76/350），其中合并1種菌占20.0%（70/350）；2種菌占1.7%（6/350）。同時培養出的菌株中肺炎鏈球菌和卡他莫拉菌最多，分別占12.0%（42/350）和5.1%（18/350）。

2.3 藥敏情況

β內酰胺酶檢測結果：所分離的350株流感嗜血桿菌中，β內酰胺酶陽性186株，占53.1% 。

分離菌對所測藥物的藥敏結果見表1。未檢出對頭孢曲松、美羅培南不敏感的流感嗜血桿菌。

經統計學分析，使用χ2檢驗比較β內酰胺酶陰性與陽性菌株敏感性，兩者對氨芐西林（P=0.001）、氯霉素（P=0.001）、四環素（P=0.001）、阿莫西林-克拉維酸（P=0.001）、頭孢呋辛（P=0.001）、阿奇霉素（P=0.001）、頭孢克洛（P=0.001）、甲氧芐啶-磺胺甲唑（P=0.001）差異有統計學意義。

表1 流感嗜血桿菌對抗菌藥物的敏感率和耐藥率Table 1 Susceptibility of Haemophilus influenzae strains to antimicrobial agents（% ）

3 討論

本研究中男性患兒的流感嗜血桿菌感染所占比例明顯高于女性， 提示男性兒童可能較易受該菌感染， 與程薇等[2]的報道一致。從流感嗜血桿菌陽性患兒的年齡構成中，我們發現該菌的感染多見于嬰幼兒。本次檢測結果顯示，流感嗜血桿菌感染主要為≤3歲患兒，占78.6%，較＞3歲兒童對流感嗜血桿菌易感。與張泓等[3]、吳華軍等[4]報道一致，略高于孫燕等[5]報道中流感≤3歲患兒占71.1%，說明3歲以下嬰幼兒是流感嗜血桿菌感染的高危人群，這與2010年CHINET細菌耐藥性監測結果相仿。幼兒鼻腔中無鼻毛，鼻黏膜柔弱且富于血管易受感染，氣管、支氣管管腔狹窄，黏液分泌少、纖毛運動差、肺彈力組織發育差等因素，容易導致病原菌擴散，加之免疫系統發育尚未健全[6]，是嬰幼兒流感嗜血桿菌感染率高的原因。接種流感嗜血桿菌疫苗，可降低流感嗜血桿菌感染[7]。

流感嗜血桿菌是引起嬰幼兒呼吸系統感染的常見病原菌之一，并在健康嬰幼兒鼻咽部具有較高的定植率。研究表明，流感嗜血桿菌可通過黏附侵入呼吸道上皮細胞，同時可通過外膜蛋白的改變逃脫機體的吞噬，從而長期在人呼吸道上定作用可使菌株產生多種生物膜，從而使其具有持久性定植和感染能力[11]。因此，流感嗜血桿菌無論是混合培養陽性，還是純培養陽性均有臨床意義。所以兒科臨床醫師在治療時應同時考慮流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌等三大兒童呼吸道常見菌及其耐藥情況，合理選用抗生素。

氨芐西林早在20世紀70年代就作為治療流感嗜血桿菌感染的首選藥物，然而，隨著其臨床應用，該菌的耐藥率也逐年上升。在本組患兒中檢出的流感嗜血桿菌對氨芐西林的耐藥率高達52%，與趙蕾[12]報道的結果相近，明顯高于黃育敏等[13]報道的11%以及陶云珍 等[14]報道的32.7%。流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥機制主要：一是產生質粒介導的β 內酰胺酶，分為TEM-1型或RoB1型，最植，是導致感染發生的前提[8-9]。本研究結果，流感嗜血桿菌主要分離自呼吸道分泌物，占98.3%，尤其以下呼吸道為主，痰最多，其次為支氣管肺泡灌洗液占18.6%， 此外，還有來自眼分泌物占1.1%，陰道分泌物占0.3%，口周的皮膚分泌物占0.3%。

流感嗜血桿菌感染患兒同時分離出其他呼吸道病原體的情況較為多見，同時分離到21.7%其他細菌，12.0%為肺炎鏈球菌，略高于楊勇文等[10]的10.8%；卡他莫拉菌占5.1%。表明呼吸道感染患兒可同時攜帶多種呼吸道條件致病菌。有研究顯示，定植于上呼吸道的流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌有共生關系，Ⅳ型菌毛結合細胞外DNA的調節常見的是TEM-1型[15]， 350 株流感嗜血桿菌共檢出186 株 β 內酰胺酶陽性菌株，產酶率達53.1%，高于2014年CHINET監測β 內酰胺酶在兒童中檢出率35.2%[16]，與趙蕾[12]報道的產酶率相近。本研究發現，流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥率和β內酰胺酶陽性率均超過50%，具有一致性，說明我院流感嗜血桿菌對氨芐西林的主要耐藥機制以產β內酰胺酶為主；二是參與細菌細胞壁合成的青霉素結合蛋白的結構發生改變，導致其對氨芐西林的親和力下降及外膜蛋白改變，后一種機制導致的氨芐西林耐藥株，被稱為β內酰胺酶陰性氨芐西林耐藥流感嗜血桿菌[17-18]。本研究中164株β 內酰胺酶陰性流感嗜血桿菌對氨芐西林中介占1.8%，其耐藥機制有待進一步研究。經統計學分析，β內酰胺酶陽性菌株對氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸、頭孢呋辛、頭孢克洛、阿奇霉素、氯霉素、四環素和甲氧芐啶-磺胺甲唑多種抗菌藥物的敏感率低于β內酰胺酶陰性菌株。阿莫西林和阿莫西林-克拉維酸是常用的口服抗生素，β內酰胺酶陰性氨芐西林耐藥或者β內酰胺酶陽性阿莫西林-克拉維酸耐藥是由于青霉素結合蛋白的改變[17]，本研究中阿莫西林-克拉維酸的耐藥率12.3%，仍可作為臨床經驗用藥。

本研究350株流感嗜血桿菌的藥敏結果顯示對甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥率最高為76.9%，高于張婧等[19]報道的71.6%，其次是氨芐西林。對β內酰胺類以外抗菌藥物，最敏感的是環丙沙星，其次為氯霉素。本研究提示磺胺類藥物已不宜推薦作為流感嗜血桿菌感染的經驗用藥，可能是由于過度產生雙氫葉酸還原酶所致[20]。 阿奇霉素是新一代大環內酯類抗生素， 對各種陰性細菌、厭氧菌及其他病原體有很強的抗菌活性，尤其對流感嗜血桿菌有較強的抗菌活性[21]。本研究中阿奇霉素不敏感率為34.6%，且均為住院患兒，明顯低于周凱等[22]報道南京地區的阿奇霉素不敏感率99.19%，與董方等[23]報道的2015年流感嗜血桿菌對阿奇霉素不敏感率40.1%相符，可能與不同地區的人口密度、抗菌藥物使用習慣有關，阿奇霉素不敏感率呈明顯上升趨勢，臨床應慎重選擇。頭孢克洛的不敏感率高于頭孢呋辛，與董方等[23]、黃鋼靈[24]報道的結果相似， 因此選用第二代頭孢菌素時需依據藥敏結果。

綜上所述，目前流感嗜血桿菌分離株中產β內酰胺酶株比例極高，氨芐西林已不能作為臨床一線用藥。兒童感染流感嗜血桿菌對常用抗菌藥物的耐藥性已十分嚴重，對流感嗜血桿菌的耐藥性進行監測，指導臨床合理使用抗菌藥物從而減慢耐藥菌株快速增長具有重要意義。

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Distribution and antibiotic resistance profile of 350 strains of Haemophilus influenzae isolated from children

ZHEN Yang, SONG Wenqi, DONG Fang, ZHENG Hongyan, ZHEN Jinghui.
（Bacteriology Laboratory, Beijing Children's Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing100045, China）

ObjectiveTo analyze the distribution and antibiotic resistance profile ofHaemophilus influenzaestrains isolated from children for better antibiotic use.MethodsThe clinical and laboratory data concerning 350 strains ofH. influenzaewere collected and analyzed retrospectively from 2014 to 2015 in our hospital, including pathogen source, production of beta lactamases and antimicrobial susceptibility. Antimicrobial susceptibility testing was carried out by using disk diffusion method. The results were interpreted according to the breakpoints of the Clinical and Laboratory Standards Association (CLSI) in 2014, and analyzed using WHONET 5.6 software.ResultsH. influenzaeinfection was more common in infants and young children. The prevalence of beta lactamase was 53.1% inH. influenzaeisolates. TheH. influenzaeisolates showed the highest resistance rate to trimethoprimsulfamethoxazole (76.9%), but relatively high susceptible rate to ciprofloxacin (99.1%), ceftizoxime (98.9%), chloramphenicol(95.4%), tetracycline (88.3%), amoxicillin-clavulanic acid (87.7%), cefuroxime (74.9%), azithromycin (65.4%), cefaclor (56.6%) and ampicillin (46.0%). All theseH. influenzaestrains were susceptible to ceftriaxone and meropenem. Conclusions Beta-lactamases are highly prevalent in theH. influenzaestrains isolated from children, which is the main mechanism underlying ampicillin resistance inH. influenzae. Ampicillin is therefore not appropriate for first-line treatment ofH. influenzaeinfections. TheH. influenzaestrains are highly resistant to trimethoprim-sulfamethoxazole. In addition to beta-lactams, ciprofloxacin is the most active agent againstH.influenzaestrains, followed by chloramphenicol.

children;Haemophilus influenzae; betalactamase; antibiotic resistance

R378.3

A

1009-7708 ( 2017 ) 06-0658-05

10.16718/j.1009-7708.2017.06.009

首都醫科大學附屬北京兒童醫院細菌室，兒科學國家重點學科，北京 100045。

甄楊（1982—），女，大專，檢驗師，主要從事細菌耐藥性研究。

董方，E-mail：fangd32@163.com。

2017-02-24

2017-05-11