健那綠B褪色光度法測定啤酒酵母中鉻含量

李人宇，黃金狀，李詠梅，周家宏

（1.連云港師范高等專科學校，江蘇連云港222006；2.淮海工學院化學工程學院，江蘇連云港222005；3.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京210023）

健那綠B褪色光度法測定啤酒酵母中鉻含量

李人宇1，黃金狀1，李詠梅2，周家宏3

（1.連云港師范高等專科學校，江蘇連云港222006；2.淮海工學院化學工程學院，江蘇連云港222005；3.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京210023）

采用微波消解樣品，堿性條件下用高錳酸鉀氧化鉻（Ⅲ）為鉻（VI），鉻（VI）在磷酸介質中與碘化鉀和健那綠B反應，使健那綠B褪色，據此建立褪色光度法測定鉻含量的新方法。結果表明：最大褪色波長為618 nm，吸光度減小值與鉻（VI）質量濃度在0～0.24 μg/mL范圍內呈線性關系，檢出限為2.95 μg/L。新建方法用于測定啤酒酵母中鉻含量，結果與原子吸收光譜法一致，相對標準偏差為0.86%～1.29%（n=5），樣品加標回收率為98.7%～101.0%。

褪色光度法；鉻；健那綠B；啤酒酵母

鉻（Ⅲ）是人體必需微量元素之一，參與糖、脂類和蛋白質的代謝，具有維持耐糖量于正常水平、促進生長發育的功能。人體內缺鉻（Ⅲ）會引發糖尿病、冠心病、兒童發育不良等疾病；但鉻（Ⅲ）過量則會危害人體健康[1-3]。啤酒酵母富含三價有機鉻，人體吸收利用率高，是天然鉻（Ⅲ）的良好來源[4]，因品質優、產量大、經濟環保等優勢應用于食品工業中[5-6]。故準確測定啤酒酵母中鉻含量具有重要意義。

據國內外文獻報道，目前鉻的測定方法主要有原子吸收光譜法[7-9]、分光光度法[10-13]、化學發光法[14-15]、電化學法[16-17]、色譜法[18-19]、質譜法[20-22]等。原子吸收光譜法、化學發光法和電化學法操作相對復雜，有的還存在較多干擾。色譜法和質譜法靈敏、準確、干擾少，但儀器昂貴，運行成本較高，需技術人員熟練操作，難以推廣應用。分光光度法儀器廉價，操作簡便，靈敏度較高，準確可靠，易于推廣普及。試驗發現，鉻（VI）能氧化碘化鉀生成I3-，I3-與健那綠B反應形成穩定的離子締合物，使健那綠B褪色，本文詳細研究了鉻（VI）-碘化鉀-健那綠B反應條件，采用微波消解樣品，堿性條件下用高錳酸鉀氧化鉻（Ⅲ）為鉻（VI），建立了褪色光度法測定啤酒酵母中鉻的新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-2550紫外-可見分光光度計：日本島津公司；SYC-15C超級恒溫水浴：南京桑力電子設備廠；pHS-3C型酸度計：上海精密科學儀器有限公司；ETHOS E微波消解儀：意大利Milestone公司；SYZ-B石英亞沸高純水蒸餾器：宜興新建石英玻璃器廠。

所用試劑重鉻酸鉀、磷酸、碘化鉀和那綠B（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司生產；試驗用水為二次蒸餾水。

鉻（VI）標準儲備溶液：100 μg/mL，稱取 0.283 0 g經105℃烘至恒重的重鉻酸鉀，用水溶解，移入1 000 mL容量瓶中，稀釋至刻度，冰箱中4℃保存。使用時稀釋成2 μg/mL標準溶液；磷酸溶液：5 mol/L；碘化鉀溶液：0.1 mol/L，用前新配；健那綠 B 溶液：5×10-4mol/L。

1.2 方法

取2支25 mL具塞比色管，其中一支依次加入3.0 mL 5 mol/L磷酸溶液，一定量鉻（VI）標準溶液或待測試液，3.0 mL 0.1 mol/L碘化鉀溶液和3.0 mL 5×10-4mol/L健那綠B溶液，用水定容至25 mL，搖勻；另一支不含鉻（VI）為試劑空白。避光反應10min。用1 cm比色皿，以水作參比，在分光光度計上618 nm處測量離子締合物體系的吸光度A和試劑空白的吸光度A0，計算△A=A0-A。

2 結果與討論

2.1 吸收光譜

按1.2方法，以水為參比，分別掃描試劑空白、離子締合物溶液，吸收光譜見圖1。

圖1 吸收光譜Fig.1 Absorption spectra

試劑空白的最大吸收峰位于618 nm，較大吸收峰位于406 nm（曲線1）；鉻（VI）在磷酸介質中與碘化鉀和健那綠B反應形成穩定的離子締合物，健那綠B褪色，618 nm處吸光度顯著減小（曲線2）。試驗選擇測定波長為618 nm。

2.2 試驗條件的選擇

2.2.1 反應介質

分別試驗了鹽酸、硫酸和磷酸介質對反應的影響。結果表明，磷酸介質的靈敏度最高。但若磷酸濃度過大，體系不穩定；若磷酸濃度過小，△A值較小。選用5 mol/L磷酸溶液，用量為3.0 mL時（見圖2），△A值最大。試驗選用3.0 mL 5 mol/L磷酸溶液。

圖2 磷酸用量的影響Fig.2 Effect of phosphoric acid amount

2.2.2 碘化鉀用量

在離子締合反應過程中，部分碘化鉀未參加反應就已被空氣氧化。為了保證鉻（VI）反應完全，碘化鉀的加入量應遠大于理論量。結果表明：選用0.1 mol/L碘化鉀溶液，用量為3.0 mL時，即可保證鉻（VI）完全反應，△A值最大（見圖3）。試驗選用3.0 mL 0.1 mol/L碘化鉀溶液。

圖3 碘化鉀用量的影響Fig.3 Effect of potassium iodide amount

2.2.3 健那綠B用量

當5×10-4mol/L健那綠B溶液用量為3.0 mL時，△A值最大（見圖4）。試驗選用3.0 mL 5×10-4mol/L健那綠B溶液。

2.2.4 表面活性劑

試驗考察了常見表面活性劑對反應的影響，結果見表1。

圖4 健那綠B用量的影響Fig.4 Effect of janus green B amount

表1 表面活性劑的影響Table 1 Effect of surfactants

由表1可知，不加表面活性劑ΔA值更大，反應效果更好，故試驗無需加表面活性劑。

2.2.5 反應溫度

當溫度在0～90℃范圍內，溫度對離子締合反應影響不大，△A值變化幅度較小；最佳反應溫度為15℃～30℃（見圖5）。試驗選擇在室溫條件下反應。

圖5 反應溫度的影響Fig.5 Effect of reaction temperature

2.2.6 反應時間

室溫避光反應10min時，△A值達到最大（見圖6）。試驗選擇避光條件下反應10 min。

圖6 反應時間的影響Fig.6 Effect of reaction time

2.3 標準曲線

分別準確移取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 鉻（VI）標準溶液，各置25 mL比色管中，按1.2方法操作并測量吸光度減小值△A，以△A為縱坐標，鉻（Ⅵ）標準溶液質量濃度ρ為橫坐標，繪制標準曲線（見圖7）。

圖7 標準曲線Fig.7 Standard curve

結果表明：△A與鉻（VI）質量濃度在 0～0.24 μg/mL范圍內呈線性關系，線性回歸方程為ΔA=2.630 4ρ（μg/mL）+0.009 9，r=0.999 6，表觀摩爾吸光系數 ε=1.37×105L/（mol·cm）。平行測定11次試劑空白，得A0的標準偏差為2.59×10-3，計算方法的檢出限（3s/k）為2.95 μg/L。

2.4 共存離子的影響

在優化的反應條件下，考察了常見離子對0.24μg/mL鉻（VI）標準溶液測定的影響，在相對誤差±5%以內，共存離子的允許量（以 μg計）如下：Na+、K+、Zn2+、Co2+、Cl-、Br-、OH-（1000），Mg2+、Ca2+、Ba2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、NO3-、CO32-、Ac-、F-、PO43-、SiO32-（500），NH4+、Al3+、SO32-（100），Cr3+、Pb2+、Se（IV）（50）。結果表明：選擇性良好，常見金屬離子有較高允許量，一般樣品可直接測定。

3 樣品分析

將啤酒酵母樣品粉碎，過60目篩，充分混勻。稱取0.2 g（精確到0.000 1 g）酵母樣品于微波消解罐中，加入6 mL硝酸和2 mL雙氧水，置于微波消解儀中按設置程序消解。在5 min內由室溫升至120℃并恒溫5 min，再在5 min內升溫至160℃并恒溫10 min，然后在5 min內升溫至180℃并恒溫10 min，消解完畢得透明溶液。冷卻后取出消解罐，在電熱板上于140℃～160℃趕酸至剩余0.5 mL～1.0 mL。消解罐放冷后，將消化液轉移至三角瓶中，用熱水洗滌坩鍋3次，洗滌液并入三角瓶中，加入40 mL水，加入2 mol/L氫氧化鈉調節pH12，滴加2%高錳酸鉀溶液，搖勻，溶液呈紫紅色，在電爐上加熱煮沸20 min，煮沸過程中溶液應保持紫紅色。若紫紅色褪去，需及時滴加高錳酸鉀溶液。加熱完畢取下后立即滴加95%乙醇使紫紅色褪去，搖勻，用1 mol/L硝酸溶液調節pH近中性，趁熱過濾，濾液置于50 mL容量瓶中，并用少量熱水洗滌3次，洗滌液并入容量瓶中，定容至刻度，待測。取2.0 mL試樣溶液按1.2試驗方法測定，并與原子吸收光譜法[10]對照，結果見表2。同時做加標回收試驗，結果見表3。

表2 樣品中鉻含量測定結果（n=5）Table 2 Results for the determination of chromium in samples（n=5）

表3 加標回收試驗結果（n=5）Table 3 Results of spiked recovery test（n=5）

4 結論

本文采用微波消解樣品，堿性條件下用高錳酸鉀氧化鉻（Ⅲ）為鉻（VI），優化鉻（VI）-碘化鉀-健那綠 B體系反應條件，建立了健那綠B褪色光度法測定啤酒酵母中鉻含量，在室溫下反應，測定速度快，儀器操作簡便，方法準確、靈敏、重現性好，所建新方法可用于啤酒酵母中鉻含量的測定。

[1]楊克敵,張天寶,王愛國,等.微量元素與健康[M].北京:科學出版社,2003:139-148

[2]王永芳.鉻與健康研究進展[J].中國食品衛生雜志,2001,13(1):45

[3]吳茂江.鉻與人體健康[J].微量元素與健康研究,2014,31(4):72-73

[4]傅永懷.微量元素與臨床[M].北京:中國醫藥科技出版社,1997:64-67

[5]吳振,江建梅,舒媛.啤酒酵母及其衍生品的應用研究進展[J].中國釀造,2014,33(10):10-13

[6]袁仲,楊繼遠.啤酒酵母抽提物的制備及其在食品工業中的應用[J].中國釀造,2008(10):67-69

[7]國家衛生和計劃生育委員會.GB 5009.123-2014食品安全國家標準食品中鉻的測定[S].北京:中國標準出版社,2015

[8]Liang Pei,Shi Taqing,Lu Hanbing,et al.Speciation of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)by nanometer titanium dioxidemicro-column and inductively coupledplasmaatomicemission spectrometry[J].SpectrochimicaActa Part B,2003,58(9):1709-1714

[9]Monasterio R P,Lascalea G E,Martínez L D,et al.Determination of Cr(Ⅵ)and Cr(Ⅲ)species in parenteral solutions using a nanostructured material packed-microcolumn and electrothermal atomic absorption spectrometry[J].Journal of Trace Elements in Medi-cine and Biology,2009,23(3):157-166

[10]楊慧,劉俊華,丁良,等.催化動力學分光光度法測定粉絲中的微量鉻[J].食品研究與開發,2014,35(6):75-78

[11]楊少江.羅丹明B雙峰雙波長分光光度法測定鉻(VI)[J].廣東化工,2016,43(23):110-112,105

[12]郭金全.5-溴-PADAP分光光度法測定水質中的鉻(Ⅵ)含量[J].食品研究與開發,2008,29(10):102-104

[13]Thorburn D,Dangolle C D F.Spectrophotometric determination of chromium(Ⅵ)by extraction of the dichromate anion into propylene carbonate[J].Analytica Chimica Acta,1997,356(2-3):145-148

[14]高向陽,高遒竹,張小燕,等.微波消解－流動注射化學發光法快速測定調味品中的微量鉻[J].中國調味品,2016,41(10):101-104,108

[15]高向陽,高遒竹,朱盈蕊,等.微波消解—流動注射化學發光法測定小麥中鉻及其生物吸收比[J].糧油食品科技,2015,23(3):62-65

[16]王征帆.庫侖分析法測定富鉻酵母中鉻含量研究[J].中國調味品,2013,38(8):102-103,120

[17]劉成倫,王晶.電化學方法在無機鉻形態分析中的應用進展[J].冶金分析,2009,29(8):40-46

[18]周桂友,侯艷芳,封琳,等.反相高效液相色譜法測定陶瓷飾品中六價鉻的溶出量[J].理化檢驗-化學分冊,2015,51(1):86-90

[19]任華莉,李琪琳,曾文法.離子色譜法測定六價鉻的研究進展[J].廣東化工,2016,43(9):239-240

[20]楊瑞春,張偉,袁鵬等.電感耦合等離子體-質譜法測定食品中的總鉻[J].光譜實驗室,2013,30(4):1853-1855

[21]楊曉穎,丁春光,閆慧芳.電感耦合等離子體-質譜法檢測全血中鉻[J].中國職業醫學,2014,41(2):208-210

[22]Krushevska A,Waheed S,Nóbrega J,et al.Interferences in the ICPMS determination of chromium and vanadium in biofluids and tissues[J].Applied Spectroscopy,1998,52(2):205-211

Fading Spectrophotometric Determination of Chromium Content in Beer Yeast with Janus Green B

LI Ren-yu1，HUANG Jin-zhuang1，LI Yong-mei2，ZHOU Jia-hong3
（1.Lianyungang Teachers College，Lianyungang 222006，Jiangsu，China；2.School of Chemical Engineering，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，Jiangsu，China；3.College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210023，Jiangsu，China）

A new fading spectrophotometric method for determination of chromium content was developed.Cr（VI）reacted with potassium iodide and janus green B in H3PO4medium，leading to the fading of janus green B after microwave digestion sample and oxidation of Cr（III）to Cr（VI）with potassium permanganate under alkaline conditions.The results showed that the maximum fading wavelength locates at 618 nm，reducing absorbance value was linear with the concentration of Cr（VI）in the range of 0-0.24 μg/mL，and the limit of detection was 2.95 μg/L.The method had been applied to the determination of Cr（Ⅲ）in beer yeast.The results obtained by this method agree well with those obtained by atomic absorption spectrometry.RSD was in the range of 0.86%-1.29%（n=5），and recovery was in the range of 98.7%-101.0%.

fading spectrophotometry；chromium；janus green B；beer yeast

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.025

2015年度國家自然科學基金面上項目（21571105）；2014年江蘇省高校“青藍工程”資助項目；2015年度連云港市第五期“521工程”科研項目（201529）；2015年江蘇省高等學校大學生創新創業訓練計劃項目（201511585003Y）

李人宇（1972—），男（漢），教授，博士，主要從事應用化學研究。

2017-04-20