分散液液微萃取-氣相色譜法測定復雜食品基質中對羥基苯甲酸酯類

何浩，陳幸鶯，*，梁林富，鐘鵬鵬，蔡永，孫映球，趙娟

（1.湘潭市食品藥品檢驗所，湖南湘潭411100；2.中南林業科技大學，湖南長沙410004）

分散液液微萃取-氣相色譜法測定復雜食品基質中對羥基苯甲酸酯類

何浩1，陳幸鶯1，*，梁林富2，鐘鵬鵬1，蔡永1，孫映球1，趙娟1

（1.湘潭市食品藥品檢驗所，湖南湘潭411100；2.中南林業科技大學，湖南長沙410004）

建立復雜食品基質中對羥基苯甲酸酯類及其鈉鹽的分散液液微萃取（Dispersive Liquid-Liquid Microextraction，DLLME）-氣相色譜（Gas Chromatography，GC）檢測方法。樣品浸泡在水中，經煮沸和超聲兩個步驟提取目標物質。取4 mL待測液，調節pH后分別加入0.6 g氯化鈉，0.3 mL四氯化碳和0.6 mL丙酮，手動和渦旋萃取，離心后取下層有機相分析，外標法定量。該方法在25 mg/kg～1 000 mg/kg范圍內線性良好，r2為0.997 2～0.999 0，回收率為95.6%～99.2%，相對標準偏差均小于4.0。對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯的定量下限為1.2 mg/kg～3.2 mg/kg。

分散液液微萃取；氣相色譜法；對羥基苯甲酸酸酯類；復雜食品基質

樣品前處理是食品添加劑檢測的一個重要步驟。食品基質復雜，各種添加劑和天然成分眾多，食品中目標物質的提取和凈化是一個復雜、繁瑣和重要的工作。食品前處理的方法主要有液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）[1]，固相萃取 （solid phase extraction，SPE）[2]、超臨界萃取（supercritical fluid extraction，SFE）[3]。各種試劑消耗量小的微萃取技術得到較大發展，主要包括固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）[4]、溶劑微萃取（solvent microextraction，SME）[5]、液相微萃取（liquid phase microextraction，LPME）[6]、單液滴微萃取（single drop microextraction，SDME）[7]等。M Rezaee[8]等首次系統地提出了分散液液微萃取方法（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME），該方法汲取濁點萃取和均質液液萃取的優點，具有萃取效率高，平衡時間快，試劑使用少，回收率和準確率高等優點，是一個集萃取和富集于一體的前處理方法。

對羥基苯甲酸酯類，俗稱尼泊金酯，是食品和化妝品中常用的一種廣譜防腐劑。GB2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[9]規定對羥基苯甲酸酯類及其鈉鹽可在醋、醬油、碳酸飲料及其醬制品中適量使用，其最大使用量為0.012 g/kg～0.5 g/kg。檢測食品中對羥基苯甲酸酯類的方法主要有氣相色譜法[10-12]、液相色譜法[13]、氣質聯用法[14]等。張茂升[15]等研究水中苯、甲苯、二甲苯的分散液液微萃取/氣相色譜-氫離子火焰（DLLME/GC-FID）測定方法，韓熠[16]等研究飲料中4種對羥基苯甲酸酯類的測定方法。學者主要對萃取劑、分散劑的種類和體積、離子強度、萃取時間等做了研究。研究主要集中于液體樣品中有機物的提取與測定，主要使用的萃取劑有三氯甲烷、四氯甲烷、二氯乙烯、乙酸乙酯、正辛醇等，分散劑主要有丙酮、乙腈、甲醇等。本文研究DLLME/GC-FID測定食品中對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的方法，采用四氯化碳作為萃取劑、丙酮作為分散劑，實現復雜食品基質中對羥基苯甲酸酯類及其鈉鹽的同時提取和測定。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

GC2010plus型氣相色譜儀（配FID檢測器）、ATY224電子天平：日本島津公司；HP-5石英毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）：美國安捷倫公司；MS3數顯型混勻器：德國IKA公司；TG16-WS臺式高速離心機：湖南湘儀公司；HH-4恒溫水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司；KQ-500VDV型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；微量進樣器（100 μL）：上海安亭微量進樣器廠。

對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯標準品：中國食品藥品檢定研究院；對羥基苯甲酸丁酯：美國AccuStandard公司；丙酮、無水乙醇、三氯甲烷、四氯化碳（色譜純）、鹽酸（優級純）：國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純）：迪馬科技有限公司；氯化鈉、二水乙酸鋅（分析純）：西隴化工股份有限公司；亞鐵氰化鉀（分析純）：天津市光復科技發展有限公司；B-廣泛試紙（pH 1～14）：上海三愛思試劑有限公司。

榨菜、醬油、食用檳榔等：當地超市。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準物質的配制

準確稱取0.1 g（精確至0.000 1 g）對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯標準物質，用丙酮溶解后移入100 mL容量瓶中，定容搖勻，4種標準物質的濃度均為1 000 μg/mL，作為標準物質儲備液，于-4℃保存。使用時用丙酮逐級稀釋至所需濃度。

1.2.2 樣品溶液的制備

準確稱取樣品約10 g于100 mL具塞比色管中，加去離子水至約80 mL，于沸水浴中放置0.5 h，取出后立即超聲0.5 h（超聲功率為500 W,超聲頻率為50 kHZ），冷卻。加入5 mL 106 g/L亞鐵氰化鉀溶液，搖勻后加入5 mL 220 g/L乙酸鋅溶液，定容，搖勻。靜置0.5 h后用中速定性濾紙過濾至250 mL錐形瓶中，樣品溶液備用。在榨菜樣品中加入 1.6、200、1 000 μg標準物質，做加標回收試驗。

1.2.3 樣品溶液和標樣前處理

用聚乙烯吸管吸取4.0 mL樣品溶液至10 mL錐形離心管中，用（1+1）鹽酸調節pH至2～5（用pH試紙檢測），加入0.6 g氯化鈉，搖勻。加入0.3 mL四氯化碳和0.6 mL丙酮，手動振蕩200次后立即放在混勻器上，1 000 r/min渦旋60 s，再手動振蕩100次，靜置5 min后放入離心機中，3 000 r/min離心5 min，用微量進樣器移取150 μL離心管底部有機相至1.5 mL進樣瓶中，在進樣瓶中補加0.85 mL丙酮，進樣瓶在混勻器上渦旋10 s，上機。

分別移取含對羥基苯甲酸酯各 10、20、30、40、50、80 μg的標準使用液于10 mL錐形離心管中，定容至4 mL，加入 1滴（1+1）鹽酸，加入 0.6 g氯化鈉，搖勻。加入0.3 mL四氯化碳，加入一定體積的丙酮（使加入的丙酮和標準物質中帶入的丙酮體積之和為0.6 mL），以下步驟同樣品溶液的制備。外標法定量。

1.2.4 氣相色譜條件

進樣量：1 μL；分流比為 10∶1；色譜柱流量：1.49 mL/min；升溫程序：80℃（保持 3 min），10℃/min到200℃，（保持3 min）再以20℃/min升溫到250℃（保持9.5 min），程序升溫總時間為30 min，進樣口溫度為220℃，檢測器溫度為260℃。

2 結果與討論

2.1 萃取劑的選擇

萃取劑應符合以下條件：第一，萃取劑的密度應顯著大于水的密度，保證離心時萃取劑聚集于錐形離心管底部；第二，萃取劑在水中溶解度應很小，離心后能顯著分層；第三，目標物質在有機相的溶解度應遠遠大于在水相的溶解度，確保萃取效率。本文比較二氯甲烷、三氯甲烷和四氯化碳作為萃取劑的萃取效率。3種試劑在20℃時密度為：二氯甲烷（1.325 g/mL）＜三氯甲烷（1.484 0 g/mL）＜四氯化碳（1.595 g/mL）。20℃時在水中溶解度為：二氯甲烷（20 g/L）＜三氯甲烷（7 g/L）＜四氯化碳（0.8 g/L）。因此，選用四氯化碳作為本次試驗的萃取劑。

2.2 分散劑的選擇

分散劑應選擇在水相和有機相都有較高溶解度的物質，在水相中將目標物質提取后，將目標物質轉移至萃取劑中。本次試驗比較丙酮、乙醇和乙腈作為分散劑時的萃取效率。試驗發現，在萃取劑四氯化碳0.3 mL，氯化鈉0.6 g條件下，在乙醇和乙腈作為分散劑時，對羥基苯甲酸甲酯和乙酯在萃取劑四氯化碳中濃度很低，而在水相中濃度較高，萃取效率不高。丙酮作為分散劑則達到了預期的效果。

2.3 萃取劑體積的優化

萃取劑體積的大小對萃取效率有重大影響。萃取體積太小，會使水相中目標物質萃取不充分；萃取體積太大，將使水相中的丙酮轉移至有機相中，降低了目標物質在萃取劑中的濃度。本次試驗比較萃取劑四氯化碳在0.1 mL～0.5 mL條件下，對羥基苯甲酸甲、乙、丙、丁酯的峰面積變化，見圖1。本文選用萃取劑體積為0.3 mL。

圖1 對羥基苯甲酸甲、乙、丙、丁酯峰面積隨四氯化碳體積變化圖Fig.1 The peak areas of methyl，ethyl，propyl，butyl paraben with the change of the volume of carbon tetrachloride

2.4 分散劑體積的優化

分散劑體積的大小直接影響萃取劑在水相中微滴的形成和萃取效率。本次試驗比較分散劑丙酮在0.1 mL～0.5 mL條件下，對羥基苯甲酸甲、乙、丙、丁酯的峰面積，見圖2。

圖2 對羥基苯甲酸甲、乙、丙、丁酯峰面積隨丙酮體積變化圖Fig.2 The peak areas of methyl，ethyl，propyl，butyl paraben with the change of the volume of acetone

對羥基苯甲酸乙酯、丙酯、丁酯的峰面積在丙酮體積在0.1 mL～0.4 mL時逐漸升高，丙酮體積在0.4 mL～1.2mL時逐漸降低。對羥基苯甲酸甲酯的峰面積在丙酮體積為0.1 mL～0.6 mL時逐漸升高，丙酮體積在0.6 mL～1.2 mL時逐漸降低。綜合考慮，選擇分散劑的體積為0.6 mL。

2.5 離子強度對萃取效率的影響

水相中適當的離子強度將使對羥基苯甲酸酯類的溶解度下降，有利于萃取效率的提高。在水相中分別加入 0.1 g～1.2 g氯化鈉（25 g/L～300 g/L），離子強度（氯化鈉添加量）見圖3。

圖3 對羥基苯甲酸甲、乙、丙、丁酯峰面積隨離子強度變化圖Fig.3 The peak areas of methyl，ethyl，propyl，butyl paraben with the change of the volume of ionic strength

由圖3可知，氯化鈉添加量為0.6 g（150 g/L）時，萃取效率達到最優值。

2.6 樣品測試

四氯化碳0.3 mL，丙酮0.6 mL，氯化鈉0.6 g的條件下，標準物質和食用檳榔樣品色譜圖見圖4和圖5，樣品檢驗結果見表1。由表1可知，2個食用檳榔和1個醬油中檢測出含有對羥基苯甲酸乙酯，其含量符合GB2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[9]要求。

2.7 方法學評估

2.7.1 保留時間、標準曲線、r2、檢出限和定量限

四氯化碳0.3 mL，丙酮0.6 mL，氯化鈉0.6 g的條件下，標準曲線、r2、檢出限和定量限見表2。

圖4 對羥基苯甲酸甲、乙、丙、丁酯色譜圖Fig.4 Chromatogram of methyl，ethyl，propyl，butyl paraben

圖5 食用檳榔樣品色譜圖Fig.5 Chromatogram of edibleareca catechu

2.7.2 富集倍數、回收率和相對標準偏差

富集倍數（enrichment factor，EF）是反應DLLME方法性能的重要參數，其數值等于萃取后萃取劑中目標物質的濃度除以萃取前水相中目標物質的濃度。假設目標物質全部被萃取至萃取劑中，且萃取前后萃取劑和水相的體積不變，則富集倍數等于水相體積除以萃取劑體積，本次試驗的富集倍數為13.3。雖然富集倍數不高，但完全能滿足試驗的要求。

表1 樣品測試結果（n=3）Table 1 Test results of the sample（n=3）

表2 保留時間、線性方程，r2、檢出限和定量限（n=3）Table 2 Retention time，linear equation，r2，detection limit and limit of quantification（n=3）

在榨菜樣品中添加對羥基苯甲酸酯類，做10、200、500 mg/kg三水平加標回收試驗，回收率和相對標準偏差見表3。

表3 回收率和相對標準偏差（n=5）Table 3 Recovery rate and relative standard deviation（n=5）

線性范圍為25 mg/kg～1 000 mg/kg。由表3可知，r2、相對標準偏差均能符合實驗室質量控制要求[17]，甲酯、乙酯、丙酯的回收率也能符合實驗室質量控制要求，但丁酯的回收率達不到要求（90%～110%）。分析試驗過程，甲酯、乙酯、丙酯和丁酯的水溶性依次變差，丁酯回收率低是樣品前處理的過程引起的，引進系數f可以有效解決這一問題，f等于1除以回收率，本次試驗f值為1.18。

2.8 創新點和試驗改進

1）學者主要分析水樣中目標物質的檢測，而本文對復雜基質食品前處理轉化為水樣待測液后進行檢測，提高了DLLME的適用范圍。2）對羥基苯甲酸酯類在不同的食品中有不同的狀態，大部分食品中以鈉鹽的形式存在，在一些食品中以酯類的形式存在。對羥基苯甲酸酯鈉鹽易溶于水，而酯類在冷水中溶解度小。本文采用沸水浴和超聲兩種提取方式，可以將食品中存在的鈉鹽和酯類完全提取出來，保證了回收率達到實驗室要求。在添加萃取劑和分散劑之前，將待測樣液pH值調至偏酸性，使對羥基苯甲酸酯鈉鹽轉化為酯類，可提高萃取效率。3）本文在萃取劑的體積上作了較大改變，多數學者將萃取劑體積設為5 μL～100 μL，而本文將萃取體積改為300 μL。萃取劑體積的增大能提高萃取效率，減少萃取時間。將150 μL萃取劑移入樣品瓶，定容至1 mL后，能實現自動進樣器連續進樣，也減少了相對標準偏差。4）本文將標準物質進行前處理后再進氣相色譜分析，將萃取效率和萃取劑體積的變化影響降到最低，提高了試驗的準確性和精密度。5）考慮到丁酯回收率不高的問題，引入系數f可以有效解決這一問題。

3 結論

本文建立復雜食品基質4種對羥基苯甲酸酯及其鈉鹽的液液微萃取-氣相色譜檢測方法。對萃取劑種類和體積、分散劑種類和體積以及離子強度等條件進行優化，得到了最佳萃取條件為待測液4 mL，四氯化碳0.3 mL，丙酮0.6 mL，氯化鈉0.6 g，加標回收率為95.6%～99.2%，線性范圍為 25 mg/kg～1 000 mg/kg，r2為0.997 2～0.999 0，RSD均小于4，是一種快速、準確、環保、節約的檢測固態和液態食品中對羥基苯甲酸酯及其鈉鹽含量的方法。

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Determination of p-hydroxy Benzoates in Complex Food Matrix Using Dispersive Liquid-Liquid Microextraction/Gas Chromatography

HE Hao1，CHEN Xing-ying1，*，LIANG Lin-fu2，ZHONG Peng-peng1，CAI Yong1，SUN Ying-Qiu1，ZHAO Juan1
（1.Xiangtan Institute for Food and Drug Control，Xiangtan 411100，Hunan，China；2.Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，Hunan，China）

A dispersive liquid liquid microextraction（DLLME）and gas chromatographic（GC）method for the determination of p-hydroxy benzoates and its salts in complex food matrix was established.Sample was soaked in water，using boiling and ultrasound two steps to extract the target material.Take 4 mL sample solution，after adjusting pH，0.6 g sodium chloride，0.3 mL carbon tetrachloride and 0.6 mL acetone were added.Using manualandvortexextraction，aftercentrifugation，the organic phase was analyzed.The linearity was good in 25 mg/kg-1 000 mg/kg using this method，r2was 0.997 2-0.999 0，the recovery rate was 95.6%-99.2%，the relative standard deviation was less than 4.0.The lower limit of quantification for methyl，ethyl，propyl，butyl paraben was 1.2 mg/kg-3.2 mg/kg.

dispersive liquid-liquid microextraction；gas chromatography；p-hydroxy benzoates；complex food matrix

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.028

湖南省食品藥品監督管理局食品藥品安全科技項目（R201715）

何浩（1986—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：食品質量安全。

*通信作者

2017-04-21